反相HPLC缓冲液

来源:Shyam VermaReporter US Volume 27.4

 高品质缓冲剂(溶液、固体或浓缩液)

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制备水性流动相是离子分析物反相色谱(RPC)方法开发中最关键的步骤。这包括考虑pH对分析物保留的影响,使用的缓冲液的类型和浓度,在有机改性剂中的溶解度及其对检测的影响,以及其他考虑因素。就缓冲类型、离子强度和pH而言,缓冲液的不当选择,可在极性或可离子化化合物的反相分离中,导致不良或不可再现的保留和拖尾。


分析物的部分电离、分析物与残留硅烷醇或固定相上的其他活性位点之间的强相互作用等问题,可通过适当的流动相缓冲(将pH保持在狭窄范围内)和选择正确的流动相中的离子种类和浓度(离子强度)来克服1-2。在严重依赖于正确选择酸、碱、缓冲类型和其他添加剂的敏感的LC-MS分离中3,必须根据其维持而不是抑制MS界面中分析物电离的能力来选择缓冲液。
 


 流动相pH和反相保留

RPC中离子分析物的保留从根本上受流动相pH的影响。离子官能团的解离性质也影响分析物的保留。非离子分析物的保留则极少受流动相pH影响。

对于酸性基团(通常为羧酸盐),低于pKa的pH(在限值内),以及对于碱性基团(通常为胺),高于化合物的pKa的pH(在限值内),都增强保留。在给定官能团的pKa附近的pH范围内,观察到对这些分析物的保留产生了非常大的影响。考虑到图1所示的化学解离,这变得很明显。


离子分析物的化学解离


图1. 离子分析物的化学解离

最后两个方程通常称为Henderson-Hasselbach方程。这些方程表明,对于远离pKa的pH值,pH值的微小变化对未质子化与质子化物质之间的比例影响很小。因此,pH的适度变化不会显著影响保留。然而,在接近pKa的pH下,pH的微小变化将造成两种物质之间的比例显著变化。因此,在离pKa足够近的数值范围内改变pH将大大影响保留。当pH用于增加反相保留时,应该朝着降低分析物电离的方向改变pH。 


 缓冲液的选择

缓冲液是弱酸与其共轭碱、或者弱碱与其共轭酸的溶液。它们可以减轻氢 / 水合氢离子以及氢氧根离子的影响,并继而降低pH波动,即使稀释后也是如此。二氧化硅类填料上反相的典型pH范围是pH 2至8。缓冲液的选择通常取决于所需的pH。重要的是缓冲液具有接近所需pH的pKa,因为缓冲液在pKa处控制pH最佳。一个经验法则是,选择pKa值比所需流动相pH值小2个单位的缓冲液(见表1)。
 

HPLC缓冲液、pKa值和有用的pH范围

表1. HPLC缓冲液、pKa值和有用的pH范围
 

磷酸及其钠盐或钾盐是反相HPLC最常用的缓冲系统。磷酸盐的两个pKa值(2.1和7.1)以及UV透明度,使其成为大多数HPLC分离的理想选择。其12.3的pKa值适合在11.3-13.3 pH范围内缓冲。在分析有机磷酸盐化合物时,可以用磺酸盐缓冲液代替膦酸盐缓冲液。随着LC-MS的普及,经常使用挥发性缓冲系统,例如TFA、乙酸盐、甲酸盐和氨。

缓冲液浓度:浓度较高的缓冲液可以提高缓冲能力,通过降低迁移分析物pH峰值的局部波动,使得在流动相pH下部分电离的化合物具有更可再现的分离。通常,10-50 mM的缓冲液浓度对于小分子是足够的。

缓冲液溶解度:执行梯度分离时这尤为重要。溶解度可以通过混合一定体积的部分缓冲液与有机溶剂来凭经验确定。有沉淀物或不透明的溶液外观就表明了溶解度问题。一般规则是缓冲液中有机物含量不应超过50%。这取决于具体的缓冲液及其浓度。

对检测的影响:缓冲液的选择还取决于检测手段。对于传统的UV检测,缓冲液需要在该区域内有效透明,这对梯度分离尤其重要。表1所列的缓冲液在220 nm以下具有足够低的吸收。

今天更常见的问题是与质谱(MS)检测的兼容性。解决挥发性问题的优选缓冲液是甲酸盐、乙酸盐和氨。关于抑制电离的问题,甲酸盐和乙酸盐是正离子模式检测的理想选择。然而,即使在正离子模式下,TFA也会对检测器响应产生负面影响4,5,同时它强烈抑制负离子模式下的电离。乙酸适用于负离子模式。LC-MS应用进一步限制了缓冲液选择和缓冲液浓度。

 

 参考文献

  1. McMaster, M.C. HPLC A Practical User’s Guide, VCH Publishers, Inc.: New York, NY, 1994; 85.
  2. Poole, C.F. and Poole, S.K. Chromatography Today, Elsevier Science: Amsterdam, The Netherlands, 1991; 431.
  3. Analytix, Five-part series on Mobile Phase Additives for LC-MS, Issue 3, 2006 (www.sigma-aldrich.com/analytix).
  4. Temesi, D., Law, B., The Effect of LC Eluent Composition on MS Response Using Electrospray Ionization, LC-GC, 17:626. 1999.
  5. Apffel, A. et. al. Enhanced Sensitivity for Peptide Mapping with Electrospray Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in the Presence of Signal Suppression Due to Trifl uoroacetic Acid-Containing Mobile Phases, J. Chrom. A. 712:177. 1995.