用GC-MS对氨基酸进行衍生化和分析

来源:Katherine K. StenersonReporter US Volume 25.3

 引言

通常使用高效液相色谱(HPLC)来分析氨基酸。然而,也可以使用GC,在某些情况下,出于对仪器可用性或者操作成本的考虑,这种方法会是更好的选择。在GC分析之前,氨基酸的极性性质需要衍生化。衍生化旨在使分析物更易挥发,反应性降低,从而改善其色谱行为。在氨基酸这种情况下,衍生化用非极性基团取代OH、NH2和SH极性官能团上的活性氢。

甲硅烷基化是一种非常常用的衍生化技术,可用于多种化合物。该方法的主要缺点是其对水分敏感。如果存在水分,可导致反应产量差,衍生化分析物不稳定。在本研究中,我们评估了甲硅烷基化试剂N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)在氨基酸衍生化中的用途。当与含有活性氢的极性官能团反应时,MTBSTFA形成叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)衍生物:

引言

图1. MTBSTFA的结构 

MTBSTFA衍生物比使用较低分子量试剂 [例如N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)] 形成的那些更稳定且对水分敏感性更低1

 

 实验步骤

将50 μL含有91 μg/mL的L-氨基酸与0.1 N HCl的混合物溶液的等分试样干燥,并加入100 μL纯MTBSTFA,然后加入100μL乙腈。将混合物在100℃下加热4小时。然后用碳酸氢钠中和样品,并在20 m × 0.18 mm I.D. x 0.18μm SLB™-5ms毛细管色谱柱上进行GC-MS分析。

 

 结果

氨基酸TBDMS衍生物的色谱图如图2所示。从尖峰处获得的光谱数据有助于鉴定氨基酸衍生物。用TBDMS基团取代活性氢使分子量增加114。这些衍生物的电子碰撞光谱2含有对应于衍生物分子量减少的典型片段CH3 (M-15)、C4H9 (M-57)、C4H9 + CO (M-85)、和CO-O-TBDMS (M-159)。图3显示了TBDMS-缬氨酸光谱中这种片段模式的一个例子。

SLB-5ms

图2. SLB-5ms(28564-U)上氨基酸衍生物的GC-MS分析 

缬氨酸TBDMS衍生物的质谱

图3. 缬氨酸TBDMS衍生物的质谱(衍生物的MW = 345)

在所用的反应条件下,大多数氨基酸产生一种衍生物,羟基、胺和巯基上的活性氢(在半胱氨酸的情况下)被TBDMS取代。有些氨基酸产生多种衍生物,特别是天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸。在这些氨基酸的情况下,反应条件的改变,例如降低温度或改变反应时间,可以防止这种情况发生3。例如,将反应时间从2小时增加到4小时,导致完全衍生形式的色氨酸的响应增加。

虽然TBDMS衍生物比传统TMS衍生物更稳定,但其较高的分子量导致GC分析期间的洗脱时间更长。为了平衡这一点,用较短、较细的毛细管柱进行分离。为了保持甘氨酸衍生物峰在溶剂中的分辨率,需要不高于100℃的起始温度。在胱氨酸衍生物洗脱后快速升温至360℃,以确保色谱柱清洁,便于后续分析。

 

 结论

该研究表明,通过适当使用衍生化试剂,如MTBSTFA,可以用GC-MS对氨基酸进行分析。为了产生目标衍生物的最大响应,可能需要“调整”反应条件。衍生物产生特征片段,以便进行MS鉴定。为了减少这些衍生物的总GC分析时间,建议使用较短、较细的柱,例如20 m x 0.18 mm I.D. x 0.18 μm SLB-5ms。

 

 材料

     

 参考文献

  1. T. G. Sobolevsky, A. I. Revelsky; Barbara Miller, Vincent Oriedo, E. S Chernetsova, I.A Revelsky, J. Sep. Sci. 2003, 26, 1474-1478.
  2. F. G. Kitson, B. S. Larsen, C. N. McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry, A Practical Guide; Academic Press: San Diego, 1996; Chapter 9.
  3. I. Molnar-Perl, Zs. F. Katona,. GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/t-butyldimethylsilyl derivatives: in model solutions III. Chromatographia Supplement, 51, 2000, S228-S236.