使用Ascentis Express苯基-己基柱的超高效液相色谱(UHPLC)

作者:Richard A. Henry, Hillel K. BrandesReporter US Volume 27.4

Richard A. Henry(2) and Hillel K. Brandes

wayne.way@sial.com

峰分辨率是灵敏、准确的色谱分析的必要条件。最近,有关Fused-Core™颗粒和亚2 μm范围内的多孔颗粒的HPLC色谱柱的报告主导了科学会议和出版物,使用这些颗粒可以大大提高分辨率和速度,对相同柱长时,可产生更高的效率(N),对较短柱长,也能提供差不多的效率。

当使用亚2 μm颗粒时,超高效液相色谱(UHPLC)的代价是压力要高得多。革命性的Ascentis Express 2.7 μm核壳二氧化硅颗粒(图1)很快就被认为是一种极具吸引力的替代品,因为它在性能上与亚2 μm范围内的颗粒相当。Ascentis Express色谱柱具有非常狭窄的粒径分布,采用传统的2 μm玻璃料,在低得多的压力下操作经久耐用,这些压力处于传统HPLC仪器的舒适区内。

 

图1. Ascentis Express的核壳结构

图1. Ascentis Express的核壳结构


 为什么我们需要不同的HPLC相?

尽管新型色谱柱技术使用传统的5 μm色谱柱可实现每米翻倍的色谱板,但如果不能通过正确选择色谱柱固定相和流动相来调节保留和选择性,那么无论怎样通常都无法无法实现所需分辨率。本文将介绍Ascentis Express苯基-己基相,它是Fused-Core色谱柱系列的新成员。本文还将介绍如何将色谱柱选择性与更高的效率结合起来,实现比以前更快的分离。

绝大多数UHPLC分离采用经典的反相(RP)模式的C18色谱柱进行,然而,供应商现在供应许多不同的相。虽然人们需要具有不同相的UHPLC色谱柱,这是不容质疑的事实,但是对于选择性不同于C18和C8、却与之互补的UHPLC色谱柱,其预期的性能如何却鲜有报道。两种最流行的极性RP相是RP酰胺(它通常被归类为嵌入式极性基团相)以及苯基(它可以通过π-π机制与溶质相互作用)。表1简要给出了Ascentis Express色谱柱系列的保留和选择性的比较。

 

 

表1. Ascentis Express色谱柱的保留和选择性一览

C18和C8相非常受欢迎,因为它们稳定、可再现且易于使用。保留能力与log P值密切相关,许多溶质的log P值都已被确定。溶质电离会造成保留以可预测的方式降低,但通过向流动相添加稀酸、碱和缓冲液,可以相对容易地加以控制。在乙腈和甲醇(或其他溶剂)之间改变流动相的有机组分,可以微调分辨率,因为溶剂化作用影响相结构和选择性。温度也是优化相选择性的一个有用变量。当溶质是非极性的或略微有极性时,具有C18和C8相的色谱柱通常会提供最佳分辨率,然而,具有极性RP相的色谱柱(例如RP酰胺或苯基-己基)通常会对极性更高的溶质显示出改善的保留和选择性。应该强调的是,即使是极性RP相,除了其所具有极性特征外,也还会具有显著的烷基相特征。RP相可以与同样的流动相溶剂和技术一起使用,具有与C18相当的相稳定性。

RP酰胺相与C18互补,因为酰胺基团具有几个独特的特征:1)当溶质可以提供或接受质子时,通过H键具有强相互作用,2)酰胺基团和二氧化硅表面之间的内部H键有效屏蔽硅烷醇,以及3)即使在100%水性溶剂中也能很好地润湿和操作。H键使得具有羧基和酚基基团的溶质保留更长时间,并且在RP酰胺上比在C18或C8上更好地分离。屏蔽作用防止含有氨基的溶质与硅烷醇相互作用,并可导致较短的保留时间和酰胺相上更尖锐的峰。酰胺相的另一个有趣特征是,当相与溶质之间发生H键合时,甲醇和其他醇会变成强得多的溶剂。除了上述特殊情况外,由于长烷基链朝离开表面的方向延伸,RP酰胺相通常与C18具有相似的性能。

由于溶质与芳环及其离域电子的相互作用,苯基相具有独特的选择性。由于这种独特的芳香性,它与C18和RP酰胺相互补(正交)。未取代的苯环是π-供体或路易斯碱,其与π-受体和任何电子缺乏的路易斯酸强烈相互作用。苯基相也倾向于表现出良好的形状选择性,这可能源于与平面环系统的溶质多点相互作用。对于具有芳香族吸电子基团(氟、硝基等)或具有离域杂环系统(例如所研究的苯并二氮杂卓化合物)的溶质,通常会观察到更多的保留和选择性。


 使用Ascentis Express苯基-己基的UHPLC的结果

苯基-己基已被证实具有高效率、低压降、以及平坦的范第姆特曲线,如图2所示。通常,对于所有Ascentis Express核壳柱,在所有HPLC仪器都能轻松耐受的压力下,具有两倍于5 μm颗粒的柱效率。注意,对于10 cm × 3 mm I.D.柱,在最佳流量下,已达到20,000个板。研究中使用了Jasco X-LC HPLC仪器。如图3所示,Ascentis Express苯基-己基柱的选择性与其他商购苯基柱非常相似,因此可以在色谱柱之间轻松转换方法。两个多孔3 μm色谱柱的效率和压降差异可以从它们不同的粒度分布来解释。

 

具有中性探针的Ascentis Express苯基-己基柱的流动性能

 

图2. 具有中性探针的Ascentis Express苯基-己基柱的流动性能

 

苯并二氮杂卓的苯基柱选择性比较

 

图3. 苯并二氮杂卓的苯基柱选择性比较

图4-6显示了在水:乙腈和水:甲醇流动相中的四种Ascentis Express RP相上分离的五种苯并二氮杂卓的比较。没有使用添加剂,以观察这些极性溶质与不同相之间的相互作用,但是通常会使用稀释缓冲液开发经过验证的方法。在中性pH下添加10-20 mM缓冲液对于用这些高度灭活的柱相进行分离几乎或完全没有影响。  

 

苯并二氮杂卓结构

 

图4. 苯并二氮杂卓结构

 

不含添加剂的35%乙腈流动相中的苯并二氮杂卓

 

图5. 不含添加剂的35%乙腈流动相中的苯并二氮杂卓

 

不含添加剂的60%甲醇流动相中的苯并二氮杂卓

 

图6. 不含添加剂的60%甲醇流动相中的苯并二氮杂卓

注意,四种键合相的乙腈总体保留相似,但洗脱顺序不同。由于疏水相互作用的优势,两种极性较小的化合物(地西泮和去甲基地西泮)洗脱较晚,并且所有的柱洗脱顺序相同。然而,极性较大的溶质则较早洗脱,并与苯基-己基和其他相发生不同的相互作用。使用这个测试样品和操作条件,四个Ascentis Express RP色谱柱中的三个提供了良好的分辨率和不同的选择性,但苯基-己基显示出最佳的保留和选择性。

在图6中,当转换为水:甲醇后,Ascentis Express苯基-己基的保留发生显著变化。在水:甲醇流动相中,与其他相相比,苯基与溶质杂环系统的相互作用要强得多,可能是通过π-π机制。Kazakevitch(1)已发表证据表明甲醇仅在芳香相上形成单层覆盖(并且还使其他相成为稀溶剂),并表现出强芳香选择性。极性化合物的洗脱顺序也与水:乙腈条件的洗脱顺序不同。对于该测试样品,Ascentis Express苯基-己基选择性在水:甲醇相中明显优于在其他相中。

开发UHPLC色谱柱的一个主要目标是通过使用较短色谱柱和大流量来获得较高的分离速度和样品通量。这些色谱柱还可提高灵敏度并减少溶剂用量。图2所示的扁平范第姆特曲线可以实现在不显著损失分辨率的情况下提高流量和流动相速度。对于在水:乙腈流动相中的中性极性测试混合物,结果显示在图7中。

 

Ascentis Express苯基-己基高速分离

图7. Ascentis Express苯基-己基高速分离


 结论

新型苯基-己基相与Fused-Core核壳颗粒配合使用,组成主要的Ascentis Express色谱柱系列。已经确认使用任何核壳颗粒相的UHPLC色谱柱都比其他UHPLC色谱柱具有更高的性能和更低的压降。Ascentis Express苯基-己基与其他苯基相具有很好的相关性,方便了方法开发和方法转换。在水:乙腈和水:甲醇流动相中,对苯并二氮杂卓化合物的选择性与其他Ascentis Express RP相进行了比较。在水:甲醇中,苯基相对这些杂环芳香族化合物显示出更多保留的可能性。结果表明了使用Ascentis Express苯基-己基以及所有Ascentis Express相进行更快、更灵敏测定的可能性。


 参考文献

  1. Kazakevitch, Y. V., et al. J. Chromatogr., A. 2005, 1082, 158–165.
  2. Consultant to Supelco/Sigma-Aldrich.