含有色心的荧光纳米金刚石颗粒:属性和应用

作者: Olga A. Shenderova 博士  ,  Adámas 纳米技术公司总裁


 引言

纳米金刚石 (ND) 颗粒越来越多地被用作生物医学中的诊断、成像和治疗剂,1 ,以及用于量子信息处理中的密码学和量子计算,纳米磁测量法中的单自旋传感器等。2,3 这些应用大多基于与金刚石点缺陷相关的独特光学和磁性特性。由于宽禁带的存在,NS 通常含有原子缺陷或杂质,其中一些具有高发光性,使其可用作荧光、阴极发光或光声成像剂。1 ND 具有出色的生物相容性,并具有固有的低细胞毒性和遗传毒性。1


 荧光纳米金刚石 (FND) 光学特性

氮是金刚石中最常见的杂质,以孤立取代氮原子或两个最近邻取代氮原子的形式存在于晶格中,此外还有许多含氮缺陷。氮原子捕获的空位根据金刚石中N态的类型形成不同的色心。导致金刚石呈红色/近红外荧光的氮空位 (N-V) 缺陷和具有亮绿色光致发光性的氮空位氮 (N-V-N) 色心(或 H3 中心)是受到最多关注的光学活性缺陷(图 1)。1-3 N-V 中心是由一个取代氮原子和一个相邻空位在金刚石中形成的缺陷,而 N-V-N 中心则由氮-空位-氮络合物组成(图 2)。用高能粒子辐照 ND 可以产生空位。随后的高温退火可导致空位扩散,并与氮原子形成色心。

金刚石的荧光基于存在于金刚石晶格中的色心:氮空位中心 (N-V)发出红色荧光(左),N-V-N(或 H3 中心)发出绿光(右)。

图1:金刚石的荧光基于存在于金刚石晶格中的色心:氮空位中心 (N-V)发出红色荧光(左),N-V-N(或 H3 中心)发出绿光(右)。

 含有 N-V 中心 (a) 和 N-V-N 中心 (b) 的 100 nm ND 颗粒的光致发光发射光谱以1mg / ml的浓度分散在DI水中。激发波长分别为532nm和442nm。在488nm (b)处的峰值对应金刚石的拉曼位移。

图2. 含有 N-V 中心 (a) 和 N-V-N 中心 (b) 的 100 nm ND 颗粒的光致发光发射光谱以1mg / ml的浓度分散在DI水中。激发波长分别为532nm和442nm。在488nm (b)处的峰值对应金刚石的拉曼位移。

N-V 中心的光学特性非常适合生物成像应用,光学激发波长为 490-560 nm,红色 \ 近红外发射波长为 (637-800 nm)(图 2a),与大多数自发荧光细胞成分差距较大。由于光在周围组织中具有更大穿透性,波长发射通常发生在低吸收的光谱窗内,对生物标记应用较有吸引力。对于带负电荷的缺陷 (N-V-),N-V 中心的光谱在 638 nm 处呈现零声子线 (ZPL),对于中性状态,在 575 nm 处呈现 ZPL(图 2a)。含有 NV 中心的 ND 的发光强度取决于颗粒中 N-V 中心的数量。例如,当使用全内反射荧光显微镜以相同条件并排测量时,100 nm ND 的 PL 亮度可能比Atto 532染料的亮度高一个数量级以上。当被蓝光激发时,H3 中心将发出最大约 530 nm 的绿色荧光(图 2b)。N-V 和 N-V-N 中心的一个显著特点是,即使在连续高能激发条件下,它们也不会发生光漂白或闪烁 4 ,该前所未有的光稳定性使其优于常规发色团。

ND 颗粒中带负电荷的 NV 中心也已成为量子传感的重要组成部分。2,3  由于 N-V-   中心的自旋态可以利用光学检测磁共振 (ODMR) 结合磁共振方法进行光学检测,且自旋态对于周围的磁场很敏感,因此含有单个 N-V-   中心的 ND 颗粒可用作适用于环境条件的超灵敏磁力计。除磁场外,N-V 中心对电场、温度和应变也表现出高敏感性。2,3


 纳米金刚石表面化学

由于色心嵌在金刚石基质中,它们的荧光特性不受表面改性的影响。1  虽然大块金刚石的表面被认为具有化学惰性,但 ND 通常含有许多含氧表面官能团(即-COOH、-OH、羰基、酯等),这些官能团是在使用强氧化剂纯化过程中产生的,或者是通过还原反应产生的(例如,使用氢化铝锂,LiAlH4)。5  ND 也可以通过氢蚀刻sp2 碳来进行纯化。良好的表面功能化可通过化学、光化学、机械化学、酶学、等离子体和激光辅助等方法来实现。5  强化学处理或极端温度的使用(即高压灭菌或液氮贮存)使 ND能够适用于医疗应用,而不会导致核心晶体结构的降解(sp3 键合)。由于有多种方法实现表面功能化,ND 可以很容易嵌入其他基质中,因而对于与蛋白质、酶、激素、抗原、DNA 或药物等生物实体通过静电和共价的相互作用进行结合十分有用。6 例如,将荧光 ND包裹在脂质层中可使ND颗粒在细胞质中的扩散增强一个数量级以上。7 ND表面具有多种有机官能团的衍生化作用,可与生物活性分子进行后续连接,非常适合于诊断和治疗应用。FND与连接了生物素标记目标抗体的链霉亲和素共价偶联后,在不同的细胞检测中均表现出较高的靶向特异性。8 为避免非特异性标记,建议使用牛血清白蛋白 (BSA) 作为稳定剂,使包覆BSA的金刚石纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐水中具有较高的抗絮凝能力。9


 应用

2005 年,FND首次被报道用于体外生物标记,10  实验证明,含有 N-V 中心的 FND可被细胞自发内化,且毒性很低。FND荧光的亮度和稳定性使它们极为适用于细胞内的单粒子追踪,4 其稳定的荧光亦可用于长期光学跟踪和纳米感应。通过对 N-V 中心荧光的时间门控检测 11 ,利用 ND 荧光相比细胞和组织自发荧光寿命(约3 ns)长得多的长寿特性(长达约20 ns),也可以改善细胞内 ND 的成像对比度。

FND的完美光稳定性通过受激发射损耗显微术 (STED) 实现了超分辨率成像9,从而能够轻松实时实现高分辨率的三维成像。使用 STED 显微镜,以约 40 nm 的亚衍射分辨率在细胞中可区分出单个 FND 颗粒 (约30 nm)。9

多光子激发成像是一种强大的工具,它可以使活体组织成像具有更长的穿透深度。它在焦点处激发荧光团,从而可减少细胞自发荧光。此外,显微镜可提高成像对比度并降低对细胞的光损伤。使用飞秒红外激光可检测细胞中的单个 FND 颗粒 (约40 nm) 。7

N-V- 中心的自旋特性,即光学检测磁共振技术,可用于改善 FND 在体外  和  体内  的成像对比度,并能克服内源性分子引起的自发荧光问题。12,13 在宽场荧光成像中, 体内  交替微波辐射只调节 N-V- 中心的荧光强度,而背景荧光保持恒定。成像处理有效去除了背景自发荧光信号,并显著提高了成像对比度。12 在另一种方法中,调制磁场被用于实现位于前哨淋巴结的 ND 中 N-V- 中心的无背景宽场成像,14 其成像对比度提高了近两个数量级。ND 中的某些色心具有阴极发光,并可在长时间电子束照射下保持稳定,从而为基于相关光和电子显微镜 (CLEM) 的生物成像技术提供了有价值的标记物。利用 CLEM 显微镜15 可获得活体 HeLa 细胞中绿色和红色 FND 的彩色成像,显示了活体生物系统中具有良好空间分辨率的结构细节。这表明它们可用于提高临床诊断的敏感性。

综上所述,含色心ND 具有明亮荧光,且没有光漂白和闪烁现象,结合其生物相容性和良好的生物功能化特性,使 ND 成为分子成像和细胞标记的理想生物探针。ND 中某些类型色心的自旋和光致发光特性的独特组合为发现基于 ND 色心的生物成像和传感的新方法开辟了新的光明前景。

 


 材料

     


 参考文献

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  3. Doherty, M.; Manson, N.; Delaney, P.; Jelezko, F.; Wrachtrup, J.; Hollenberg, L. C.L. Phys. Rep. 2013, 528, 1–45.
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