Cultrex® 3-D球状体荧光增殖/活力检测实验方法

用于研究球形细胞增殖及活力的试剂盒

货号 3510-096-K

 

I. 背景

目前的体外肿瘤模型缺乏用于体外评估肿瘤细胞的生理背景或可重复形式。如今最常用的化合物筛选和通路分析方法涉及在刚性、经组织培养处理的塑料表面培养癌细胞,其中细胞可通过非特异性地粘附并以单层增殖。但这样导致的结果就是细胞失去形态和在体内肿瘤相关的基因表达谱。也可以将单细胞悬浮液包埋在细胞外基质(ECM)水凝胶中以构建3-D培养1-3;然而,所得结构会分散在整个凝胶中,并且在形态和大小方面表现出显着的可变性,限制了生理梯度的建立并且对每个测定的重复性产生不利影响。为了解决重复性问题和构建更多生理肿瘤系统,可将已建立的多细胞球体形成方法整合到3-D培养模型中。 40多年来,研究人员一直在使用球状体培养物进行癌症研究,但关于哪种细胞系可自发形成球状体仍存在限制。自发的球状体组装中细胞会产生ECM并在球状体外表面上形成沉积,而同时不能自发形成致密球状体的细胞系则不能形成ECM4,5。后续的研究表明,向非球状体细胞中加入ECM蛋白可诱导自发球状体形成,使得球状体形式与大多数实体瘤细胞模型相容。6Cultrex® 3-D球状体荧光增殖/活力检测为使用此方法对细胞进行评估提供了必要试剂。仅需简单地收获细胞并重悬于球状体形成ECM,然后在96孔球状体形成平板中进行培养。球状体通常可在48至72小时内形成。细胞数量和培养时间决定了球状体的大小,并且由于每个孔产生一个球状体,研究人员可完全控制球体尺寸并几乎不会具有变异性。对于大多数肿瘤模型,我们推荐直径为400-500μm的球状体。由于通过多细胞层进行扩散的限制,这足以建立营养物、氧气、pH和分解代谢物的生理梯度。另一个影响这些梯度的是建立核心有坏死细胞、深层有静止细胞及球状体表面有增殖细胞的异质细胞群;所有这些因素都让人联想起无血管肿瘤。7-10一旦形成聚集体,这些多细胞肿瘤细胞聚集体可用药理化合物处理,以评估对肿瘤球状体生长的影响;也可可以通过操纵特定基因或通路以评估它们对体外肿瘤扩增的影响。该过程可通过使用图像分析软件进行实时且无标记的监测以测量球状体面积,并且该试剂盒还提供荧光细胞活力试剂刃天青以进行定量的终点分析。非荧光性的刃天青在线粒体中会被还原成荧光刃天青(激发波长530-560 nm/散射波长590 nm)

 

II. 产品描述

3-D球状体荧光增殖/活力检测可为体外肿瘤响应模型建立提供一种有效的工具。该试剂盒利用符合3D培养要求的96孔球状体形成平板以及专门的球状体形成ECM来促进细胞的聚集和球状体形成。在球状体形成完成后,可以用药理学试剂处理球状体以评价药物处理后的肿瘤活力。肿瘤球体扩张在显微镜下可以被观察到,并可通过图像分析软件进行定量,以进行实时并无标记评估。在测定结束时,可以使用刃天青通过荧光评估细胞活力。3-D球状荧光增殖/活力测定提供体外、标准化、三维、高含量的形式用于诱导多细胞肿瘤球状体(MCTS)形成以及在对药理学处理进行响应时球状体内的细胞活力进行定量。

3-D Spheroid Fluorometric Proliferation/Viability Assay

图1. 3-D球状体应该增殖/活力检测的步骤

 

III. 成分


成分 货号 含量 储存条件
10X球状体形成ECM 3500-096-01 600 µL –80 ⁰C,避免反复冻融
符合3D培养要求的 96孔球状体形成平板 3500-096-002 EA 室温
刃天青 3510-096-01 2.5 mL –20 ⁰C,避免反复冻融


IV. 所需的自备试剂及设备

  • 设备

1. 层流罩或洁净室

2. 37 ⁰C CO2培养箱

3. 低速摇摆斗4 ⁰C离心以及用于细胞收集的管子

4. 细胞计数板或其他细胞计数方法

5. –80 ⁰C冰箱

6. 冰桶

7. 标准光学显微镜(或倒置显微镜)

8. 移液器及移液器辅助装置

9. 带有4X物镜及数码照相机的明场显微镜

10. 计时器

11. 计算机

12. 图像分析软件,如ImageJ

13. 作图软件,如Microsoft® Excel®

14. 荧光酶标仪(激发波长530-560 nm及散射波长590 nm)

  • 试剂

1.  目的细胞系

2.  细胞收集缓冲液;EDTA,胰酶或其他细胞粘附缓冲液

3.  组织培养生长培养基

4.  可加入细胞培养基中的药物试剂(如有必要)

5.  磷酸盐缓冲液(货号 P5493)或 Hank平衡液溶液(货号H9269)用于洗涤细胞

6.  台盼蓝(货号 T6146)或类似活力染料

  • 一次性耗材

1.  25 cm2 (货号 C6231)或75 cm2 (货号 C7106) 经组织培养处理的Greiner培养瓶

2.  (货号SIAL0790)及50 ml(货号SIAL0828Sigma® 离心管

3.  Sigma® 血清移液器,1、5和10 ml (货号SIAL1485SIAL1487SIAL1488)

4.  1 - 200 µL (货号P5037)及200 – 1000 µL移液吸头

5.  手套

 

V. 注意事项及限制

1.  仅限科研使用。不可用于诊断过程

2.   这些产品的物理,化学和毒理学特性尚未得到充分研究;因此,我们建议在使用这些化学试剂时使用手套、实验服和护目镜

3.   CULTREX®3-D球状体荧光增殖/活力检测包含吞咽或与皮肤或眼睛接触可能有害的试剂。如果接触眼睛,立即用大量清水冲洗并就医

 

VI. 制备指南

1. 10X Spheroid Formation ECM

10X Spheroid Formation ECM应当在4 ⁰C冰上解冻并用组织培养生长培养基进行稀释后冷却到4 ⁰C;利用血清移液器上下吹打以进行混匀。细胞在1X 球状体形成 ECM中进行悬浮,并向符合3D 培养要求的96孔球状体形成平板的每孔中加入50 ul的细胞悬浮液

2. 刃天青

刃天青应当在室温条件下解冻并通过轻轻颠倒以制备成均匀的溶液。解冻后,刃天青可在4 ⁰C稳定保存一个月,或分装后在-20 °C冻存数月。

3. 带有细胞侵袭调节成分的组织培养基

向组织培养基中加入2X浓度的侵袭调节成分来弥补球状体嵌入到侵袭基质中造成的总体积改变。组织培养基在加入到凝胶侵袭基质时必须保持37 ⁰C以维持凝胶属性。

 

VII. 储存及稳定性

产品在手动除霜冰柜中–20 ⁰C条件下,自发货日期开始可稳定至少3个月。为获取最佳的稳定性,请将其储存在–80 ⁰C。避免反复冻融

 

VIII. 检测方法

以下步骤应该在采用杀菌技术的生物学层流罩中进行以防止污染

A. 细胞收集

根据制造商的建议进行细胞培养。建议采用以下程序并可能需要对其进行优化以适应所研究的细胞类型

1.  细胞在用于检测之前应当处于健康状态并保持增殖。细胞应当传代2至3次并通过台盼蓝或类似的方法对细胞活力进行评估。在细胞活力达到90%之前不要开始检测

2.  每孔大约需要2,000 – 5,000个细胞,而25及75 cm2 培养瓶可分别产生至少1 x 106和3 x 106 的细胞。请相应合理安排。

3.  在收集前,对细胞进行观察并记录健康状态、相对数量及形态。

4.  用无菌PBS或HBSS将细胞洗涤两次。每25 cm2 培养瓶使用5 ml而每75 cm2 培养瓶使用10 ml。

5.  收集细胞。对于25 cm2 或75 cm2培养瓶,分别加入1ml或2ml细胞收集缓冲液(参见所需自备材料),并在37 ⁰C孵育5-15分钟直到细胞完全从培养瓶底部解离。

6.  将细胞转移至15 ml锥形管中,并加入5 ml的细胞培养基。

7.  将细胞200 x g离心3分钟形成沉淀,去除培养基并用2ml的细胞培养基对细胞进行悬浮。可能需要血清移液器上下吹打细胞以重悬细胞并将细胞打散。在计数前对细胞进行观察以确认单细胞悬浮液的形成且没有发生细胞聚集。

8.  对细胞计数并通过台盼蓝或其他类似检测对细胞活力进行评估。

9.  在细胞培养基中将细胞稀释至每毫升1 x 106 细胞

B. 3-D球状体荧光增殖/活力检测

1. 检测准备 – 第0天之前

1.  确定检测参数及适当的对照。适当的对照包括含有或为含有增殖/活力调节试剂的样品,以及不含细胞的样品以确定背景。

2.  确定每种细胞系的最佳接种密度。通常可以从每孔3000开始。最佳的接种密度可以通过采用球状体形成方法(VIII.A.)对球状体形成的尺寸分析后而进行预估。可在每孔中对细胞进行梯度稀释以绘制标准曲线;这对于评估球状体尺寸及刃天青荧光曲线的线性度可能会有作用(IX.3.)。

3.  按照制造商的建议对细胞进行培养;贴壁细胞应当培养至80%以下的融合度。

4.  在4 ⁰C 冰箱里进行10X 球状体形成 ECM过夜冰上解冻。

2. 球状体形成 – 第0天

1.  按照VIII.A.章节中指导进行细胞收集并计数。

2.  在1X球状体形成ECM中进行单细胞悬浮液制备。参考V1.1章节进行试剂准备。

3.  在符合3D培养要求的96孔球状体形成平板的每孔中的1X 球状体形成ECM中加入50 ul单细胞悬浮液。

4.  在吊桶式转子中200 x g室温离心3分钟。

5.  I在组织培养箱中37 ⁰C孵育72小时以促进球状体的形成。

 

表1. 稀释方案(10%额外量用于多孔加样)

试剂 1孔 24孔 96孔
10X 球状体形成ECM (4 ⁰C) 5 µL 132 µL 528 µL
细胞培养生长培养基(4 ⁰C) 45 – X µL 1188 – X µL 4752 – X µL
细胞 X µL X µL X µL
总计 50 µL 1320 µL 5280 µL

 

3. 3D培养球状体处理 – 第3天

1. 视需要加入50 ul含有增殖/活力调节成分的预热(37 ⁰C)细胞培养基。可参考V.3章节进行试剂制备。

2. 将平板在37 ⁰C组织培养箱中孵育3至6天,并使用4X物镜每24小时对每个孔中的球状体进行拍照。调整光照和焦距,以提供3D结构和背景之间最大的对比度。对表达荧光蛋白或具有荧光标记的细胞使用荧光显微镜也可以改善对比度和随后的分析。在处理过程中,碎片可能会转移到96孔板的底部;在拍摄之前用镜头纸擦拭孔的底部可以提高清晰度。如果需要,该检测可以进行超过6天,但可能需要更换细胞培养基以维持细胞活力。

3. 采用图像分析软件对图像进行分析以测量结构在面积上的改变,以确定每个样品的3-D培养球状体扩张程度。

4. 图像分析
注意:图像可采用ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/)等免费软件进行分析,如下所示。其他图像分析软件也可通过配置以达到同样的测量目的;请向相应的软件供应商咨询相应的功能和使用方法

1. 采用4X物镜对已知尺寸(如1mm)进行拍摄并在ImageJ中进行像素测量

1. 打开图片。进入File/Open并选择图片。

2. 选择线工具。

3. 画一条线长度的对象。

4. 进入Analyze/Measure并记录像素数。

5. 计算每mm的像素数(如600像素/mm)。记录结果------- 像素/mm。

2. 选择标尺;该步骤在每次打开ImageJ后均进行

1. 进入Analyze/Set Scale。

2. 在“Distance in pixels”中输入VIII.B.4.v中的值(上方)。

3. 在“Know distance”中输入“1,000”。

4. 在“Unit of Length”中输入“um”。

5. 勾选“Global”并选择“OK”。

3. 分析球状体图像。

1. 打开图片。进入File/Open并选择图片

2. 转换成8字节图片:进入Image/Type/8 bit(勾选)。

3. 调整图片阈值。进入Image/Adjust/Threshold(勾选)。该程序将会对暗和明像素进行区分,而阈值则会通过滑动标尺而在柱状图上发生调整。相似的调整可同样适用于相同条件下拍摄的照片。暗像素的区域将会被红色覆盖。调整阈值使得仅有球状体图像被覆盖。

4. 选择球状体。选择圆形工具并对图像进行环绕。这会使得球状体之外的任何暗像素从测量中去除。

5. 进入Analyze/Measure这会在表格中对球状体结构的面积(μm2)进行测量。在一张表中更可进行多重测量。保存表格。

6. 将表格转换至Excel工作表中。打开Excel并“另存为”.xls或.xlsx文件.

Process for analysis of spheroid expansion

图2. 用于球状体扩张分析的处理。A) 捕获图像并转换成8字节;B) 设置阈值以捕获整体的结构;C) 选择结果以计算总面积。

5. 荧光分析

1. 每孔中加入十分之一体积(每100ul加入10ul)的刃天青并将平板返还至37 °C细胞培养箱中。参考VI.3章节进行试剂制备。

2.  在第1至4小时内每1小时用激发波长530-560 nm/散射波长590 nm进行荧光读取。最佳的读取可提供最大的动态范围、最佳的线性度以及最小的标准偏差。

3.  对数据进行作图。

 

IX. 数据解读

1. CULTREX® 3-D球状体荧光增殖/活力检测可对球状体增殖/活力提供形态和定量的分析。随着细胞增殖,球状体的尺寸在扩大,也导致随着时间的推移,增殖细胞系的表面积发生变化,如图3所示。可对这些表面积的变化进行测量并用于比较不同细胞系或经历基因操作的细胞系的相对增殖。

Spheroid Growth of MDA-MB-231 breast cancer cells.

图3. MDA-MB-231乳腺癌细胞的球状体生长。在球状体形成EMC的存在下每孔接种3,000个细胞并在37 °C, 5% CO2 条件下培养72小时。此事,加入50ul的完全培养基至每孔中,并将球状体置于37 °C、5% CO2孵育。每隔24小时对球状体进行拍照并使用ImageJ软件对图像进行分析

 

2. 面积的变化也可用于评估药理学化合物对球状体生长的影响。一旦建立了最佳测定条件,就可以将其评估为终点测定。使用不同浓度的抑制剂博来霉素处理的MDA-MB-231细胞进行以下测定

1. 首先,计算每种条件的面积,这些值用于生成平均值和标准偏差

MDA-MB-231 treated with Bleomycin
 

2. 接下来减去处理前的每个球状体的面积来确定球状体的扩张。

Spheroid Expansion Area
 

3. 最后将产生的面积除以未作抑制剂对照处理获得的面积,以对照百分比的形式作为增殖指数。

Proliferation Index as a Percentage of Control
 

3. 采用刃天青进行的荧光终点法分析可采用基于细胞接种密度而生成标准曲线。下列的检测是采用MDA-MB-231细胞从每孔3,000个细胞经梯度稀释至每孔94个细胞,并在第0天和第7天测量而进行的。

1. 首先对每孔采用530-560 nm/590 nm散射波长进行相对荧光单位(RFU)的测量,并采用Excel对每个样品的平均值和标准误差进行计算。

RFU Spheroid Seeding Density
 

2. 随后减去每个样品的背景值,对数据作散点图并加入趋势线以评估细胞接种密度和RFU之间的关系。

Cell Seeding Density and RFU trendline
 

4. 采用刃天青进行荧光终点法分析还可用于评估药物成分对于细胞活力的影响。以下检测是通过采用不同浓度的抑制剂博来霉素来对MDA-MB-231细胞进行处理而进行的。

1. 首先对每孔采用530-560 nm/590 nm散射波长进行相对荧光单位(RFU)的测量,并采用Excel对每个样品的平均值和标准误差进行计算。

RFU for cells treated with Bleomycin

 

2. 随后减去每个样品的背景值。

Background Corrected RFU for Cells Treated with Bleomycin
 

3. 随后,经背景校正的RFU被被未作抑制剂对照处理获得的面积相除,以对照百分比的形式作为增殖指数。

Viability Index as a Percentage of Control
 

4. 采取抑制剂曲线的线性部分进行IC50的预测。

IC50 ~ 30 µM Bleomycin for MDA-MB-231 spheroids.

IC50 ~ 30 µM博来霉素用于MDA-MB-231球状体。

 

故障排除指南

问题 可能原因 建议方案
细胞未形成球状体 细胞健康状况不佳 在球状体形成之前评估细胞倍增率并检查细胞活力。
细胞系不能形成球状体 可能存在某些上皮来源的癌细胞系可能不形成球状体。该试剂盒可能与该细胞系不兼容。
 

法律信息

Cultrex是Trevigen, Inc.公司的注册商标

 

材料

     

 

参考文献

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