碱性磷酸酶检测试剂盒(荧光法)

 

 产品描述

碱性磷酸酶(AP)基因通常用作报告基因,用于确定启动子和增强子的强度、确定转录因子的作用、评估转染效率以及衡量分子克隆尝试成功与否。

碱性磷酸酶检测试剂盒具有以下优点:

  • 该检测方法安全、易用,可提供快速、可重复的结果。
  • 酶非常稳定。
  • 人胎盘碱性磷酸酶(SEAP)突变体设计为可从细胞中分泌出来。可以随时间使用等份培养基重复无损地测量其在相同细胞样品中的活性。这节省了细胞提取物的制备时间。

使用的检测方法是荧光法,比比色法的灵敏度至少高10-100倍。荧光法在很宽的酶浓度范围内均呈线性,因此特别适合进行比较分析。

 

 组分

该试剂盒提供的试剂足够进行300次反应体积为200 µl的反应。

 

荧光检测缓冲液(货号B6558) 50 ml
稀释液(货号B6433) 6 ml
50 μl碱性磷酸酶对照酶(0.1 mg/ml,货号C9361) 1小瓶
4-甲基伞形酮磷酸二钠  (货号M8168) 2 x 1 mg


 需自备的设备和试剂

 

 注意事项和免责声明

本产品仅供研发使用,不可用于药物、家用或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据手册。

 

 储存/稳定性

将试剂盒保存于-20 °C。

 

 操作步骤

本说明适用于96孔板格式。如果以更大规格进行测定,则应相应增加体积。

注:建议为每个实验添加阴性和阳性对照:

  • 阴性对照指示背景水平。用65 °C孵育、不含分泌型AP的培养基作为检测分泌型碱性磷酸酶的阴性对照。未转染细胞的细胞裂解物或用非相关质粒转染的细胞可用作检测非分泌型碱性磷酸酶的阴性对照。
  • 阳性对照可确认检测条件是否准确。此外,对所提供的对照酶进行连续稀释可以指示活性检测的线性范围。建议从1:100稀释开始。对照酶的活性为20-50单位/mg蛋白,其中一个单位在pH 10.4、37 °C条件下每分钟可水解1 mmol对硝基苯基磷酸酯。

1. 制备底物溶液 - 将1mg 4-甲基伞形酮磷酸二钠溶于330 µl去离子水中(10 mM)。充分混合。建议将溶液分装到琥珀色容器中,不使用时–20 °C储存。

2. 解冻缓冲液 - 将足以进行整个实验的量的缓冲液平衡至室温。
第一次解冻荧光检测缓冲液和稀释缓冲液后,缓冲液可2-8 °C储存。

3. 准备检测用的样品 - 对于分泌型碱性磷酸酶,收集培养基。对于非分泌型碱性磷酸酶,收集细胞裂解液。强烈建议使用CelLytic™产品。

4. 将样品65 °C孵育15-30分钟。如果使用的是96孔板,每孔加入20 µl样品。添加阴性对照样品。65 °C孵育可使背景活性和磷酸酶活性最低。作为报告基因进行克隆的碱性磷酸酶基因的大部分蛋白产物在65 °C下是稳定的。如果您不确定报告蛋白是否稳定,可以65 °C孵育样品,每隔几分钟对报告蛋白进行取样,持续30分钟,以此来优化该步骤。或者,您可以降低热灭活温度。

5. 将样品冷却至室温。可以在冰上孵育2分钟,然后将样品平衡至室温。

6. 添加缓冲液 - 每孔加入20 µl稀释液和160 µl荧光检测缓冲液。或者,以1:8的比例制备含有稀释缓冲液和荧光检测缓冲液的混合物,并向每孔加入180 µl。

7. 添加底物 - 每孔加入1 µl 10 mM底物溶液并混合。或者,将底物溶液稀释4倍(1体积底物加3体积去离子水)。每孔加入4 µl稀释的底物并混合。

8. 读板 - 荧光计设置为360 nm激发波长和440 nm发射波长。由于酶的活性随时间增加,因此建议在加入底物后的几个时间点读板。读数间隔期间,将板在室温下避光孵育。

 

 疑难解答

如果检测到的AP活性过高:

  • 对样品进行稀释或检测少量样品,并对阴性对照进行相同处理。
  • 如果阴性对照中检测到的活性过高,则延长65 °C孵育步骤。在检测对L-高精氨酸(例如SEAP)具有抗性的碱性磷酸酶时,另一种选择是加入试剂L-高精氨酸盐酸盐,使得终浓度为10-15 mM。
  • 如果培养基样品中的AP背景活性很高,则尽量减少培养基的血清百分比(尽可能低),因为培养基中含有血清会增加背景活性。

如果检测到的AP活性较低:

  • 确保最佳的转染条件,包括DNA载体的性质及纯度、板中的细胞数等。
  • 检测分泌型AP时,使用不含酚红的培养基。
  • 增加细胞转染到细胞收集/培养基收集的时间段,使得基因表达的时间更长。
  • 比较存在或不存在待测培养基/裂解物的情况下阳性对照的活性,以此证实检测的样品中不含抑制因子。

 

材料

 
     

 

CelLyti为Sigma-Aldrich®的商标

Biotechnology LP and Sigma-Aldrich Co.

ND,EB,AC,PHC,MAM 03/08-1