酶法测定淀粉酶活性(淀粉酶活性测定)

本测定实验方案适用于利用淀粉酶活性测定试剂盒(MAK009)对细胞和组织培养物上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的淀粉酶活性进行比色测定。采用酶偶联法测定淀粉酶活性,该方法中底物亚乙基-pNP-G7被淀粉酶切割,按比例产生比色产物(405 nm)。每单位指25 °C下每分钟切割亚乙基-pNP-G7产生1.0 µmole对硝基苯酚所需要的淀粉酶的量。
 

注意事项及免责声明

本产品仅供研发使用,不适用于药物、家庭或其他用途。有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。
 

试剂

淀粉酶测定缓冲液           25 mL
   产品编号:MAK009A

淀粉酶混合底物            5 mL
   产品编号:MAK009B

淀粉酶阳性对照物            1 vl
   产品编号:MAK009C

硝基苯酚标准品          150 µL
   产品编号:MAK009D
 

需要但未提供的试剂和仪器:

96孔平底板 — 建议使用透明板(产品编号:M4436或者等效物)进行比色分析。

分光光度计多孔板读数器
 

制备说明

开瓶前需短时离心。 使用超纯水制备试剂。避免反复冻融以保持试剂的完好。

淀粉酶测定缓冲液 — 使用前放置至室温。

淀粉酶阳性对照物 — 加入50 µL淀粉酶测定缓冲液。反复移液以充分混合,等量分装后于-20 °C保存。在2个月以内使用。
 

储存 / 稳定性

本试剂盒采用冰袋运输。建议-20 °C避光保存。

操作步骤

所有的样品和标准品均应一式两份。

用于比色检测的硝基苯酚标准品
在96孔板中分别加入0、2、4、6、8、10 µL 2 mM的硝基苯酚标准品,得到0(空白)、4、8、12、16、20 nmole/孔的标准品。每孔加水至50 µL。

样品制备
将组织(100 mg)或细胞(4 x106)中加入0.5 mL淀粉酶测定缓冲液。均质后在13,000 x g 离心10分钟,弃去不溶物。

血清和尿液可以直接加入孔中。

在96孔板上分别加入1-50 µL样品。添加淀粉酶测定缓冲液至每孔50 µL。

注意:对于未知样品,建议尝试几种不同的样品稀释度以保证读数在标准曲线的线性范围内。

对于阳性对照物(可选),需在孔中加入5 µL淀粉酶阳性参照物溶液并用淀粉酶测定缓冲液添加至50 µL。

测定反应

1. 根据表1准备主反应混合物,每个反应(孔)需加入100 µL主反应混合物。

表1.
 

试剂 体积
淀粉酶测定缓冲液 50 µL
淀粉酶混合底物 50 µL

2. 在每个装有样品、标准品和阳性对照物的孔中加入100 µL主反应混合物。使用水平摇床或者移液器充分混合。

3. 在2-3分钟(Tinitial)后,测定405 nm处的吸光度(A405)initial

注意:(A405)initial必须在标准曲线的线性范围内。

4. 将板置于25 °C培养,每5分钟测定一次吸光度(A405)。在培养期间需避免光照。

5. 继续测量直到活力最高样品的吸光度高于最大浓度标准品(20 nmole/孔)对应的吸光度。此时,活力最高样品的吸光度已接近或超过标准曲线的最大线性范围。

6. 用于测定酶活力的最终测定吸光度[(A405)final] 应该是倒数第二个读数的值即活力最高样品吸光度接近或超过标准曲线最大线性范围之前的那个值(参见步骤5)。倒数第二个读数的时间即Tfinal

注意:最终测定值必须落在标准曲线的线性范围之内。
 

结果

计算

从标准品和样品的最终测定值 (A405)final 中减去硝基苯酚空白对照品的最终测定值(A405)final 以校正背景误差。 

 注意:每次测定都必须建立新的标准曲线。

 

计算样品从Tinitial到Tfinal吸光度的变化。

 

              ∆A405 = (A405)final – (A405)initial

 

将每个样品的∆A405与标准曲线进行比较,得出淀粉酶从Tinitial到Tfinal生成的硝基苯酚的量(B)。

 

样品的淀粉酶活性可以通过如下公式计算:

 

淀粉酶活性 = B x 样品稀释倍数

                    (反应时间)x V

 

B = 从Tinitial到Tfinal生成的硝基苯酚的量(nmole)

反应时间 = Tfinal – Tinitial (分钟)

V = 加入孔中的样品体积(mL) 

 

淀粉酶活性的单位是nmole/min/mL。一个单位的淀粉酶是指25 °C下每分钟切割亚乙基-pNP-G7产生1.0 µmole

对硝基苯酚所需要的淀粉酶的量。


材料