寡核苷酸退火实验方案

本实验方案用于两条序列互补的单链寡核苷酸的退火反应(图1)。加热后冷却有助于杂交反应的进行。

退火反应示例图。

图1. 退火反应示例图。加热“打破”了所有的氢键,从而破坏了每个寡核苷酸内的全部二级结构。随后,缓慢的冷却促进了杂交反应,最终在互补的序列间形成新的氢键。


 寡核苷酸退火实验方案的定义/缩写

  • EDTA - 乙二胺四乙酸
  • NaCl - 氯化钠
  • Trizma® - Tris(三羟甲基氨基甲烷)的商名


 寡核苷酸退火实验方案的设备

  • 恒温槽,或者
  • 热循环仪


 寡核苷酸退火实验方案的耗材

  • 2 mL 离心管
  • 移液器吸头
  • Milli-Q® H2O
  • EDTA(Sigma-Aldrich货号:E9884
  • NaCl(Sigma-Aldrich货号:S3014
  • Trizma® (Sigma-Aldrich货号:93362
  • 两条序列互补的单链寡核苷酸


 寡核苷酸退火实验方案的方法

该退火反应分为两个主要的步骤:1)溶解,2)退火,使用恒温槽或者热循环仪。

溶解

尽管每种寡核苷酸都是已知量的,我们仍然建议使用分光光度计进行验证, 这可以保证加入反应的每种寡核苷酸是等量的。

  • 将每种寡核苷酸溶解在一定体积的退火缓冲液(请参阅补充说明)中使得浓度相同。
  • 每种寡核苷酸溶液的浓度都需要是双链寡核苷酸目标浓度的2倍。

示例

双链寡核苷酸目标浓度为50 µM。

  1. 寡核苷酸1:标注OD值为10.55(312.6 µg, 49.9 nmol),使用分光光度计验证OD值。
  2. 寡核苷酸2:标注OD值为9.04(279.7 µg, 45.9 nmol),使用分光光度计验证OD值。
  3. 由于每种寡核苷酸原液的浓度都需要是双链寡核苷酸目标浓度的2倍,因此,每种原液的浓度需要达到100 µM。
    1. *对于寡核苷酸1,需添加 49.9 x 10 = 499 µL的退火缓冲液以得到100 µM的原液。
    2. 对于寡核苷酸2,需添加 45.9 x 10 = 459 µL的退火缓冲液以得到100 µM的原液。

*以上为配制100 µM溶液的简单计算方法,仅作为示例。更多的计算寡核苷酸浓度的方法,请参阅处理指南和稳定性

退火

恒温槽

  1. 在离心管内混合等体积的等摩尔浓度的寡核苷酸。
  2. 将离心管于95 °C培养5 min。
  3. 将离心管置于室温缓慢冷却(应<60 min)。

热循环仪

相对于恒温槽,热循环仪的稳定性更好。

  1. 在PCR管内混合等体积的等摩尔浓度的寡核苷酸。
  2. 使用下面的温度设定程序:
    1. 加热至95 °C并保持2 min。
    2. 在45 min内冷却至25 °C 。
    3. 冷却至4 °C 以短期保存。
  3. 对PCR管短时离心并弃去上层水分。

在恒温槽或者热循环仪操作后,得到的双链寡核苷酸可以用于后续操作或者用于保存。更多关于保存核苷酸的信息,请参阅处理指南和稳定性


 寡核苷酸退火实验方案的补充说明

文中提到的退火缓冲液为内部操作程序中使用。连接酶和激酶缓冲液可商购获得。所有的缓冲液均使用Milli-Q纯水。

退火缓冲液配方(1X)

  • 10 mM Tris, pH 7.5 - 8.0
  • 50 mM NaCl
  • 1 mM EDTA

连接酶缓冲液配方(1X)

通常用于T4 DNA连接酶。

  • 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 10 mM MgCl2
  • 1 mM ATP
  • 10 mM DTT

激酶缓冲液配方(1X)

通常用于T4多核苷酸激酶。

  • 70 mM Tris-HCl, pH 7.6
  • 10 mM MgCl2
  • 5 mM DTT

材料