脂肪酶的测定程序


 原理

用分光光度法在545 nm处测量醌亚胺染料的外观。


 单位定义

一个单位在下述条件下每分钟导致形成一微摩尔甘油(半微摩尔醌亚胺染料)。


 方法

试剂
 

A. 橄榄油乳剂 :将5.0 g橄榄油 [试剂级(高度精制,低酸度)] 和5.0 ml 5.0% Triton X-100溶液(B)的混合物超声处理10分钟(20 KHz)。向油乳剂中加入25 ml 4.0% BSA溶液(C)和15 ml 0.1 M K磷酸盐缓冲液,pH 7.0(D),并混合。(应该现配现用)
B. Triton X-100溶液 :5.0%(5.0 ml Triton X-100 / 100 ml H2O)
C. BSA溶液 :4.0% [4.0 g牛血清白蛋白 / 100 ml H2O]
D. K-磷酸盐缓冲液,pH7.0 :0.1 M
E. TCA溶液 :0.2 M(33 g三氯乙酸 / 1,000 ml H2O)
F. MES-NaOH缓冲液 :50 mM MES缓冲液,pH 6.5 [将9.76 g 2-(N-吗啉代)-乙磺酸酸(MW = 195.23)溶解于大约850ml H2O中,用5.0 N NaOH调节pH至6.5,最后用H2O定容至1,000 ml]
G. 显色剂 :按以下顺序,将下列化学品和酶溶于200 ml 50 mM MES缓冲液(F)中:
4.0 ml
0.04 ml
4.0 mg
24.2 mg
40.7 mg
200单位
500单位
300单位
Triton X-100溶液(B)
N,N-二乙基-间甲苯胺(搅拌至完全溶解)
4-氨基安替比林
ATP·Na2·3H2O
MgCl2·6H2O
甘油激酶
L-α-甘油磷酸氧化酶
过氧化物酶(红棓酚单位)
  (如果在4℃下储存在琥珀色瓶中,可稳定保存一周)
H. 酶稀释剂 :20 mM K-磷酸盐缓冲液,pH 7.5,含有2.0 mM MgCl2和0.5 mM EDTA-Na3


 操作步骤

(第1步)

1. 将2.0 ml橄榄油乳剂(A)吸移到试管中,在37℃下平衡约5分钟。
 

测定混合物中各成分的浓度
K-磷酸盐缓冲液 29.1 mM
橄榄油 90.9mg/ml
MgCl2 0.18 mM
Triton X-100 9.1 %
EDTA 45 μM
BSA 1.8 %

2. 加入0.2 ml酶溶液*并混合。

3. 在37℃下恰好15分钟后,加入2.0 ml TCA溶液(E)以终止反应,并用滤纸(Toyo-Roshi No.131或Whatman No.42)过滤除去沉淀物

(第2步)

4. 将所获得的0.05 ml滤液移液到试管中。

5. 加入3.0 ml显色试剂(G),37℃下孵育15分钟。

6. 对照水,测量545nm处的光密度(OD测试)。

与此同时,制备空白试剂:在37℃下用2.0 ml TCA溶液孵育15分钟后,首先混合2.0 ml橄榄油乳剂(A),然后加入酶溶液(第1步)。使用从混合物获得的滤液,按照与测试相同的程序步骤进行第2步,并测量545nm处的光密度(OD空白)。

* 将酶制剂溶解于冰冷的酶稀释剂(H)中,并在测定前立即用相同的缓冲液稀释至0.4 - 1.2 U/ml。


 计算

可以使用以下公式计算活性:

重量活性(U/mg)=(U/ml)×1 / C
 

Vt-1 :第1步总体积(4.2 ml)
Vt-2 :第2步总体积(3.05 ml)
Vs-1 :样品体积(0.2 ml)
Vs-2 :第2步中的样品体积(0.05 ml)
28.2 :测定条件下醌亚胺染料的毫摩尔消光系数(F/微摩尔)
1/2 :基于1摩尔H2O2产生半摩尔醌亚胺染料的换算系数
1.0 :光程长度(cm)
t :第1步的反应时间(15分钟)
df :稀释因子
C :溶解时的酶浓度(c mg/ml)

 

此操作程序仅供参考。有关我们的质量控制程序的最新版本,请联系我们的技术服务部


 材料