使用BCIP / NBT底物进行免疫检测

5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)/ 硝基蓝四唑(NBT)是一种理想的不溶性底物,可与碱性磷酸酶一起使用。该系统产生蓝紫色产物。可以目视观察到强烈的颜色,非常稳定,并且在暴露于光时不褪色。

以下的蛋白印迹孵育和洗涤步骤在室温下在轨道摇床上进行。将一抗在来自TBS中的二抗宿主动物的1%正常血清中稀释。其他非干扰蛋白质(例如BSA、血红蛋白、卵清蛋白)可以被替代。如果使用PVDF膜,条件可能需要优化。

  1. 在一抗中孵育蛋白印迹后,用足够的TBS / TWEEN洗涤硝酸纤维素膜4次,每次5分钟。
  2. 以适当的稀释度将膜在碱性磷酸酶-二抗缀合物中孵育1小时。(对升级的碱性磷酸酶缀合物,在TBS / TWEEN中的比例为1:30,000)
  3. 在TBS中洗涤膜4次,每次5分钟。
  4. 根据包装说明准备SIGMAFAST™ BCIP/NBT片剂(产品编号:B5655)。也可以使用液体BCIP/NBT底物(产品号:B1911)。
  5. 将膜在底物混合物中孵育10-30分钟直至显色。
  6. 在蒸馏水中洗涤膜数次,每次都换水,以停止反应。
  7. 将膜风干,并在暗处储存于塑料套管中。

注意:干膜可以在2-8°C下储存于塑料套管中两张吸墨纸之间。


 材料