细胞培养步骤 6: 使用血球计数器进行细胞计数

ECACC Laboratory Handbook 第四版

细胞培养步骤 6: 使用血球计数器进行细胞计数


 目的

对于大多数需进行细胞培养的操作,如转染,细胞融合技术,冷冻保存和传代培养等,有必要在操作前对细胞数进行定量。使用相同数量的细胞将保持最佳生长,并有助于使用细胞培养的程序标准化。这反过来也使结果具有更好的再现性。


 材料

  • 细胞培养基: 预热到适当的温度(参考 ECACC 细胞系数据表中适当的培养基和温度)
  • 70%(v / v)的酒精溶于无菌水中 (793213)
  • 台盼蓝溶液(T8154)
  • 含0.05% 胰蛋白酶/EDTA的HBSS溶液, 不含Ca2+/Mg2+ (T3924)


 设备

  • 个人防护用品(无菌手套、实验服、安全面罩) 
  • 水浴设置为适当温度 
  • 微生物安全柜具有合适的生物安全水平
  • 离心机
  • CO2 培养箱
  • 血细胞计数器
  • 倒置相差显微镜
  • 预标记烧瓶


 步骤

  1. 如前所述(方案 3 和 4),使用胰蛋白酶/EDTA 将贴壁细胞和半贴壁细胞悬浮于悬液中,并在至少与胰蛋白酶体积相当的新鲜培养基中重悬。对于成团生长的细胞,离心后在小体积中重悬,轻轻移液以吸碎成团。
  2. 无菌条件下吸除 100-200μl 细胞悬液。
  3. 加入等体积的台盼蓝(稀释倍数 =2),轻轻移液混匀。
  4. 清洁血细胞计数器。
  5. 用水或哈气湿润盖玻片。轻压盖玻片,使其在计数室内来回滑动,直到出现牛顿折射环(牛顿折射环在盖玻片下视为彩虹状环)。
  6. 用细胞悬液(约 5-10μl)填充计数室两侧,用 x20放大倍数在倒置相差显微镜下观察。
  7. 计数活细胞(亮细胞)和非活细胞(染成蓝色)的数量。理想情况下应计数 >100 个细胞,以提高细胞计数的准确性(见下文注意事项)。请注意获得>100细胞计数的方格数。
  8. 使用下面的公式计算活细胞和非活细胞的浓度以及活细胞的百分比。


 关键点

  1. 台盼蓝有毒,是潜在的致癌物。应穿戴防护服、手套和面部/眼睛护罩。不要吸入蒸汽。

  2. 计数室的中心面积为 1mm2。该区域被细分为 25 个更小的方格 (1/25mm2)。每一个方格都被三线包围,然后进一步分成 16小块 (1/400mm2)。计数室深度 0.1 mm。

  3. 校正因子 104  将 0.1mm3  转换为 1ml (0.1mm3 = 1mm2 x 0.1mm) 

  4. 有几个影响准确性的因素: 
    • 计数室中存在气泡和碎片。
    • 计数室过满,使样品流入通道或其他室
    • 计数室不够充盈。
    • 细胞未均匀分布于整个计数室。
    • 计数细胞太少。这可以通过离心细胞,在更小的体积重悬以及重新计数来解决。
    • 计数细胞太多。这可以通过使用更高稀释倍数的台盼蓝来解决,例如 1:10

  5. 血细胞计数器的使用可能较为耗时,易受操作者主观判断的影响,并且某些细胞类型,如形成簇的细胞类型,尤其难以用这种方法计数。细胞核计数技术,如 NucleoCounter (Chemometec),是另一种细胞定量方法。与其他细胞定量方法不同,细胞核自动计数器无需人工计数,也不依赖于细胞的保留物理和/或形态学特性。将小体积(如 200μl)制备样品吸入盒中,插入细胞核计数器,大约 30 秒内可获得细胞计数。

使用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。

 

图1.使用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。活细胞含有完整的细胞膜,不吸收台盼蓝,在血细胞计数器中显得明亮/清晰。死细胞已破坏细胞膜并吸收台盼蓝,在血细胞计数器中呈现蓝色。可以通过获取活/死细胞的比率来估计细胞活力。