转化的实验方案

分子生物学指南里可以找到更多实验方案和指南。

开始转化之前:

  • 准备LB琼脂板并使其凝固。如果使用预先灌装板,请确保将板加热至37°C。
  • 根据质粒DNA中存在的抗生素标记,在LB琼脂中加入适当的抗生素。
  • 如果需要对重组体进行蓝/白筛选,则在LB琼脂中加入1 mM IPTG、300 μg/ml S-Gal或40 μg/ml X-Gal以及500 μg/ml柠檬酸铁铵。
  • 如果使用电转感受态细胞,请将电穿孔室置于冰上。
  • 将水浴加热至37°C。
  • 将无菌SOC培养基加热至室温(或在水浴中升温至20-25°C)。


 使用化转感受态细胞转化的实验方案

所需材料(未提供):

 

试剂 设备
SOC培养基(产品编号:S1797) 摇床培养箱(37°C)
LB琼脂EZMix™ (产品编号:L7533) 柜式培养箱(37°C)
适当的选择抗生素 加热水浴(37°C)
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)
(产品编号:I6758)
15 ml聚丙烯培养管(无菌)
X-gal(产品编号:B9146) 培养皿
S-Gal™ (产品编号:S9811) Lazy-L无菌涂布器(产品编号:Z376779)
柠檬酸铁铵(产品编号:F5879)  


 标准转化实验方案

 

将所需数量的试管从-70°C冰箱转移到湿冰中。如果需要,额外取用一个试管用于对照DNA。
让细胞解冻5分钟。轻弹培养管多次以获得均匀的悬浮液。
对于对照:将1 μL(10 ng)pUC19对照DNA加入一个试管中。轻弹试管以便混合,并置于冰上。 将1 ng至50 ng纯化的质粒DNA直接加入其余试管的细胞中。轻弹试管以便混合,并置于冰上。
将细胞在冰上孵育30分钟。
将细胞转移到37°C水浴中静置刚好45秒。
将细胞转移至冰上静置2分钟。
将SOC培养基添加到每个试管中。将细胞转移到无菌聚丙烯 试管中,并松开盖子以便培养物通气
将细胞在摇床培养箱(225-250 rpm)上于37℃孵育1小时。
移取10-100 μL每种转化的细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂板上,并用无菌涂布器涂抹。
将板在37℃孵育过夜。
根据需要选择一个(多个)菌落和培养物。
从每种培养物中分离质粒DNA。
使用限制酶消化质粒DNA,用凝胶电泳分离。
培养优选的克隆。


 使用电转感受态细胞转化的实验方案


所需材料(未提供):

 

试剂 设备
SOC培养基(产品编号:S1797) 摇床培养箱(37°C)
LB琼脂EZMix™ (产品编号:L7533) 柜式培养箱(37°C)
适当的选择抗生素 加热水浴(37°C)
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)
(产品编号:I6758)
15 ml聚丙烯培养管(无菌)
X-gal(产品编号:B9146) 培养皿
S-Gal™ (产品编号:S9811) Lazy-L无菌涂布器(产品编号:Z376779)
柠檬酸铁铵(产品编号:F5879) 培养皿


 标准转化实验方案

 

将所需数量的试管从-70°C冰箱转移到湿冰中。如果需要,额外取用一个试管用于对照DNA。
让细胞解冻5分钟。轻弹培养管多次以获得均匀的悬浮液。
将SOC培养基转移至培养管中,每个转化反应一个管,并置于室温下。

(SOC培养基的体积取决于下一步中将要添加的细胞体积。感受态细胞和SOC培养基的最终体积应为1000μL。)
将1 mm标准比色皿和无菌微量离心管置于冰上,每个转化反应配一套。
将感受态细胞转移到冷冻的微量离心管中。使用来自80 μL包装的40 μL细胞以及来自100 μL包装的50 μL细胞。
对于对照:将1 μL的1至5倍稀释的pUC19对照DNA添加至一个试管中。 在TE缓冲液中制备DNA或Ligation Mix的1至5倍的稀释液。添加至微量离心管中。
将DNA和细胞混合物移液到冷冻的1mm比色皿中。
将电穿孔仪设置为25 kV/cm的场强6ms,并处理细胞。
从比色皿中取出细胞,添加至含有SOC培养基的试管中。
将细胞在摇床培养箱(225-250 rpm)上于37℃孵育1小时。
移取10-100 μL每种转化的细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂板上,并用无菌涂布器涂抹。
将板在37℃孵育过夜。
根据需要选择一个菌落和培养物。
从每种培养物中分离质粒DNA。
使用限制酶消化质粒DNA,用凝胶电泳分离。
培养优选的克隆。

 

优化转化过程的重要提示:

  • 确认收到时细胞仍处于冷冻状态,且仍然有干冰。
  • 为了获得最大的转化效率,请使用不含苯酚、乙醇、蛋白质、盐或去垢剂的优质DNA样品。使用电转感受态细胞时,DNA中的高盐含量会导致高压电弧,这可能会损坏样品和设备。
  • 含有优质试剂的连接反应中的DNA可用于转化。DNA连接酶不需要灭活。
  • 始终将感受态细胞保持在冰上,防止细胞意外升温。
  • 轻弹培养管以获得均匀的细胞悬浮液。请勿使用涡旋或移液器混合。
  • 将LB琼脂板温热至37°C,以获得最佳的菌落生长。
  • 使用电转感受态细胞进行转化的电穿孔仪设置:
    • BTX型ECM 630:HV模式,2.5 kV,25 µF,100 Ω,1 mm比色皿
    • BioRad基因脉冲发生器:2.5 kV,25 μF,100Ω,1 mm比色皿


 材料

     

参考文献

  • Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1989.
  • Dubnau, D., DNA uptake in bacteria. Annu Rev Microbiol.53:217-44 (1999).
  • Lorenz, M.G., and Wackernagel. W., Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev.58(3):563-602 (1994).