细胞培养实验室的设计与设备

Cook Book  2010年9月第12卷,细胞培养实验室基础技术手册 - 第2版

 2.1 实验室设计

在组织培养中,最被低估的一个方面,也许是需要设计确保以安全、有效方式生产优质材料的设施。大多数组织培养是在实验室进行的,这些实验室已经适应了这一目的和不理想的条件。然而,只要遵循一些基本准则,这不应该影响工作质量。

良好的组织培养设施的设计有几个方面。理想情况下,工作应在一次性设施中进行,如果可能的话,应将其分为保留用于处理新接收材料的区域(检疫区域)以及已知无污染物质的区域(主要的组织培养设施)。如果不可能,则应在不同时间单独完成对清洁材料的所有操作之后,再进行涉及“检疫材料”的操作。还应指定不同的培养箱。除此之外,应在每项工作之间彻底清洁工作台面。

所有新材料都应作为“检疫材料”处理,直到它被证明没有污染物,如细菌、真菌、特别是支原体。在共用设施中进行组织培养需要周全的计划,并且必须始终使用良好的技术来最大限度地降低污染发生的风险。

对于大多数细胞系,实验室应至少达到危险病原体咨询委员会(ACDP)指南(ACDP,1995)规定的2类水平。然而,所要求的确切类别取决于细胞系和拟进行的工作的性质。该指南针对实验室环境提出了建议,包括照明、供暖、工作台面类型、地板、手动洗涤设施条件等。此外,建议实验室相对于走廊应该处于负压状态,以将任何风险限制在实验室内。

危险病原体咨询委员会(1995年)《根据危害和遏制类别对生物制剂进行分类》,第4版,健康与安全执行委员会(HSE)书籍,英国萨德伯里(www.hse.gov.uk)。
 

 2.2 微生物安全柜

微生物安全柜可能是细胞培养的最重要设备,因为如果操作正确,它将为产品提供清洁的工作环境,同时保护操作员免受气溶胶的危害。在这些机柜中,通过使用HEPA(高效微粒空气)过滤器,对操作员和/或产品提供保护。所提供的遏制程度取所于所使用的机柜类别。机柜可以通过第二个HEPA过滤器连接到大气或再循环,然后才排放到大气中,见图1

 

微生物安全柜气流模式图

 

图1. 微生物安全柜气流模式图。

在机柜内使用Tryptose Soya Broth琼脂沉淀板进行环境监测至少四小时,是判定机柜清洁程度的一个很好指标(参见“9.5环境监测”)。在这些板上不应该有细菌或真菌的生长。

在大多数情况下,2级机柜足以用于动物细胞培养。但是,必须对每项研究的危害风险进行评估,并且其他因素(如已知病毒的感染或不确定的起源)可能需要更高的遏制水平。
 

 2.3 离心机

离心机常规用于组织培养,是大多数细胞系传代培养程序的一部分,另外还用于制备冷冻保存的细胞。由于其自身性质,离心机产生气溶胶,因此有必要将这种风险降至最低。这可以通过购买带有密封桶的型号来实现。理想情况下,离心机应有一个透明盖子,这样不用打开盖子即可观察上样状况。如果离心管在离心过程中破裂,盖子可降低操作员暴露于危险物质的风险。应始终注意不要过度填充离心管,并小心地平衡它们。这些简单的步骤将降低气溶胶的风险。离心机应位于易于清洁和维护的位置。应经常检查离心机是否有腐蚀迹象。

具有受控制动的小型台式离心机足以满足大多数用途。细胞在80 - 150 × g下即可达到令人满意地的沉淀效果。更高的离心力可能会导致损伤并加剧细胞沉淀的凝集。
 

 2.4 培养箱

细胞培养需要严格控制的生长环境。常规使用专业培养箱,以可控且稳定的方式提供正确的生长条件,例如温度、湿度和CO2水平。通常,它们可以设定在28℃(对于昆虫细胞系)至37℃(对于哺乳动物细胞系)的温度下运行,并可设定提供所需水平的CO2(例如5-10%)。一些培养箱还具有控制O2水平的功能。铜包被培养箱现已上市。据报道,铜的微生物抑制活性降低了培养箱内微生物污染的风险。在培养箱水盘中加入杀菌剂亦可降低细菌和真菌生长的风险。但这些都不能取代定期清洁。
 

 2.5 工作台面和地板

为了保持清洁的工作环境,实验室表面(包括工作台面、墙壁和地板)应光滑且易于清洁。它们还应具有防水性,并能抵抗各种化学品(如酸、碱、溶剂和消毒剂)的腐蚀。在用于在液氮中储存材料的区域中,如果任何液氮溢出,地板应能耐开裂。有关使用液氮的安全注意事项,请参阅第7.4节。此外,地板和墙壁的连接处应由裙边覆盖接续,以便清洁,并减少灰尘积聚的可能性。窗户应该是密封的。工作台面应设置在舒适的工作高度。
 

 2.6 塑料器皿与耗材

几乎所有类型的细胞培养容器以及诸如试管和移液管等相配的耗材,市面上均有一次性使用的无菌包装产品。供应商包括Sigma-Aldrich、Nunc、Greiner、Bibby Sterilin和Corning。使用这些塑料器皿比回收玻璃器皿更具成本效益,能够提供更高水平的质量保证,并且无需验证清洁和灭菌程序。塑料组织培养瓶通常都是处理过的,具备亲水表面,以促进贴壁依赖性细胞的附着。 



来自Corning的T形瓶

来自Corning的T形瓶
 

 2.7 实验室区域的保养与维护

为了保持清洁和安全的工作环境,整洁是关键。所有泄漏泼洒应立即处理。应进行常规清洁,包括清洁微生物安全柜内部和外部的所有工作表面、地板、以及所有其他设备,例如离心机。加湿培养箱是一个需要特别注意的区域,因为水盘中可能存在真菌和细菌生长。这将有造成污染的风险,只能通过定期清洁培养箱来避免。所有主要设备应由合格的工程师定期维护和维修,例如:

  • 应每六个月检查一次微生物安全柜,以确保在产品和用户保护方面使用安全。这些测试确认气流正确,并且HEPA过滤器正常运行。
  • 应使用NAMAS(英国国家测量和采样认证局)或等效校准温度计定期检查培养箱的温度,并在必要时调节温度。
  • 还应定期检查培养箱中的CO2和O2水平,以确保维持正确水平。