利用紫外-可见分光光度法测定磷脂氧化

 定义

根据比尔定律(Beer’s Law),利用过氧化磷脂在234 nm处的吸光度计算其浓度,可测定磷脂的氧化百分比。

 适用范围

适用于不饱和磷脂。

 设备

  • 紫外/可见分光光度计
  • 德国豪玛(HELLMA)UV石英比色皿(QS 1.000)
  • 无尘纸
  • 一次性玻璃试管

 试剂

 实验步骤

  1. 制备DPPC样品。 制备至少3 mL浓度为1mg/mL的DPPC溶液,溶剂为乙醇/蒸馏水(9:1)
  2. 制备样品。 制备至少3 mL浓度为1mg/mL的磷脂样品溶液,溶剂为乙醇/蒸馏水(9:1)。
  3. 测定空白对照吸光度。 空白对照(背景)是指用于溶解磷脂样品的溶剂。
    • 使用溶剂冲洗比色皿3次,以洗去比色皿中的所有残留污染物。
    • 使用对照溶液填充比色皿体积的3/4。
    • 使用无尘纸擦掉比色皿外壁的所有指纹和污染物。
    • 将比色皿插到分光光度计上,测定空白对照吸光度。
  4. 测定DPPC样品吸光度。
    • 将比色皿中的空白对照溶剂倒掉。
    • 使用DPPC样品溶液填充比色皿体积的3/4。
    • 擦掉比色皿外壁的指纹。
    • 将比色皿插到分光光度计上,测定DPPC吸光度。
  5. 测定样品。
    • 将比色皿中的DPPC样品倒掉。
    • 使用溶剂冲洗比色皿3次,以洗去比色皿中的所有残留DPPC。
    • 使用磷脂样品填充比色皿体积的3/4。
    • 擦掉比色皿外壁的指纹。将比色皿插到分光光度计上,测定样品吸光度。
    • 从样品吸光度中减去DPPC吸光度,并记录磷脂样品在234 nm处的吸光度数值(光密度,OD)。

 计算

过氧化脂质的浓度(D) = A/(B*C)
A =在234 nm处的吸光度数值(OD)
B =消光系数 = (OD*mL)/(mmol*cm)(过氧化脂质为27,000)
C =光路径长度,单位为cm 氧化百分比= D/E * 100
D =过氧化脂质的浓度,单位为mg/mL
E =磷脂样品的浓度= 1.0 mg/mL

 参考文献

  • R.S. Kim & F.S. LaBella (1987). Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid Res. 28:1110-1117.

 材料

     
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