Duolink® PLA明场实验方案

该实验方案描述了如何使用Duolink® PLA试剂明场检测、可视化及定量组织和细胞样本中的单个蛋白、蛋白修饰以及蛋白互作。为了更好的了解Duolink® PLA技术,可 下载我们的产品手册并查看“如何优化Duolink® 邻位连接检测”以获取更多详情。更多实验方案,请参阅Duolink® PLA荧光实验方案以及Duolink® PLA Probemaker用户指南

材料和设备
Duolink® PLA明场实验方案
结果
故障排除

材料
参考文献

 

材料和设备

Duolink® PLA 试剂

请参阅Duolink® PLA产品选择指南获取具体的产品推荐。简单来说,需要以下Duolink® PLA产品才能进行用于明场检测的Duolink® PLA实验:

  1. Duolink® PLA探针(来自不同物种的PLUS及MINUS各一个,与您的一抗宿主物种相匹配)。每个试剂盒含有:
    a) PLA探针 – PLUS和/或MINUS,具体取决于产品。
    b)  封闭液 – 用于抗体孵育前的样品封闭。一滴封闭液约相当于40 uL。
    c) 抗体稀释液 – 用于PLA探针或必要情况下一抗的稀释。
    注:将所有成分4°C储存。

    注:
    Duolink® PLA Probemaker PLUS 和/或Probemaker MINUS可视需要用于生成定制的PLA探针。请参考Probemaker指南获取更多详情。

  2. 用于明场的Duolink®检测试剂。每个试剂盒含有两种包装:

    试剂盒A(-20°C储存):
    a)  连接液储液(5x) - 稀释至1x连接液
    b) 连接酶(1 U/µL) – 加入制备成连接溶液。
    c) 扩增液储液(5x) – 稀释至1x扩增液
    d) 聚合酶(10 U/µL)  - 加入制备成扩增溶液
    e) 检测缓冲液储液(5x)  –稀释至1x检测缓冲液

    试剂盒B(4°C储存)
    a) 过氧化氢 – 用于淬灭内源性过氧化物酶活性
    b) 底物试剂A-D  – 需要用于HRP酶反应
    c) 核染色剂 –– 用于复染

  3. 用于明场的洗涤液 (洗涤液A)


其他材料

  1. 在玻片上的样品(细胞或组织),经过固定、通透、脱蜡或抗原修复等预处理。请参考“如何优化Duolink®邻位连接检测”获取更多建议以及以下主题的更多信息:
    a) 实验设计及对照
    b) 一抗的选择及优化
    c) 样品处理
  2. 所选择用于检测目的蛋白的一抗。结合Duolink® PLA探针使用时,一抗必须从小鼠、兔或山羊体内获取。
  3. 高纯水(无菌过滤,Milli-Q或同类制剂)
  4. 二甲苯 – 用于在非水相封片介质中进行封片前的脱水
  5. 乙醇 – 用于在非水相封片介质中进行封片前的脱水
  6. 适合于IHC染色玻片的非水相封片介质(如用于组织学的DPX Mountant)


设备

  1. 带图像采集相机和软件的明场显微镜
  2. 37°C孵育箱
  3. 轨道振荡筛
  4. 加热湿度培养箱
  5. 用于测定反应面积的疏水性笔
  6. 冰冻模块(用于酶)
  7. 染色罐
  8. 手术钳
  9. 移液器及吸头(从1uL至1000uL)
  10. 24x50 mm盖玻片, #1.5

Duolink® PLA 明场实验方案

以下实验方案适用于玻片上1 cm2的样品,需要40uL的溶液充分覆盖。该体积可根据您的反应面积和样品数量来相应地调整。所有的孵育都应当在湿度培养箱中完成。所有的洗涤步骤都应当在至少含有70 mL缓冲液的染色罐中在室温条件下通过轻轻地搅动而进行。

 

试剂制备

  1. 洗涤液A应当在检测开始前制备完成,通过高纯水将一袋内含物溶解至1000 mL终体积。溶液可在室温条件下短期储存(最长达两周)或4°C长期储存。
    注:在使用前需要将溶液平衡至室温。

  2. 许多Duolink® PLA试剂都以浓缩的储液形式提供,需要在临使用前稀释。不要储存稀释后的Duolink® PLA试剂。

 

Duolink® PLA 明场实验方案

首先,样品应位于玻璃玻片上并经过固定、通透化、脱蜡以及抗原修复等预处理过程。查看“如何优化Duolink ® 邻位连接检测”以了解详情。

  1. 过氧化物酶淬灭
    注:将组织样品孵育在过氧化氢中以抑制内源性过氧化物酶的活性。孵育时间根据不同的组织类型会有所不同,因而需要用户优化。

    a) 利用疏水性笔在玻片上圈出反应的区域。该过程在整个实验流程中根据需要可能会重复多次。
    b) 每1 cm2样品加入1滴(~40 uL)的过氧化氢溶液。确保覆盖整个样品。按需进行调整。
    c) 根据您的细胞或组织类型将玻片室温孵育适当的时间。
  2. 封闭
    a) 将过氧化氢溶液从玻片上移去。
    b) 在室温下用1x 洗涤液A将玻片洗涤2x 5分钟。
    c) 将Duolink® 封闭液进行涡旋混匀。
    d) 每1 cm2样品加入1滴(~40 uL)的Duolink® 封闭液。确保封闭液覆盖整个样品。
    e) 将玻片放在37°C湿润培养箱孵育60分钟。
  3. 一抗孵育
    注:在一抗加入前不要让玻片变得干燥,否则会增加背景噪音。

    a) 将Duolink® 抗体稀释液涡旋混匀。
    b) 用Duolink® 抗体稀释液将一抗稀释至合适的浓度。
    c) 将Duolink® 封闭液从玻片上移去。
    d) 加入一抗溶液至每份样品。
    e) 在湿润培养箱中进行孵育。请选择适合于相应一抗的温度和时间。
  4. Duolink® PLA探针孵育
    a) 将PLUS和MINUS PLA探针进行涡旋。
    b) 将PLUS和MINUS PLA探针用Duolink®抗体稀释液按1:5进行稀释。
       对于40 uL反应,使用8 uL的PLA探针MINUS储液,8 uL的PLA探针PLUS储液以及24 uL
    的抗体稀释液。
       为所有的样品制备充足的溶液。

    c) 将一抗从玻片上移去。
    d) 在室温下用1x 洗涤液A将玻片洗涤2x 5分钟。
    e) 移去多余的洗涤液并加入PLA探针溶液。
    f)  将玻片在湿润培养箱中37°C孵育1小时。
  5. 连接
    注:临加入样品前再向连接液中加入连接酶。确保连接液在室温完全融化并在使用前充分混匀。

    a) 用高纯水按1:5将5x Duolink®连接液进行稀释并混匀。
       对于40 uL反应,加入8 uL 5x连接液至32 uL高纯水。
       为所有的样品制备充足的溶液。

    b) 将PLA探针溶液从玻片上移去。
    c) 在室温下用1x 洗涤液A将玻片洗涤2x 5分钟。
    d) 在洗涤过程中,将连接酶从冰柜中拿出并放置在冷冻模块中(-20°C)。
    e) 按1:40将连接酶加入至1x连接液并进行混匀。
       对于40 uL的连接溶液,将1 uL连接酶加入39 uL 1x连接液。

    f) 将多余的洗涤液移去并加入连接溶液。
    g) 将玻片在预热的湿润培养箱中37°C孵育30分钟。
  6. 扩增
    注1:邻加入样品前再加入聚合酶。
    注2:不同的抗原修复过程可能需要不同的扩增时间。对于热介导的表位修复,需要扩增120分钟。对于酶介导的抗原修复,需要扩增90分钟

    a) 用高纯水按1:5稀释5x 扩增液并混匀。
       对于40 uL的反应,加入8 uL的5x扩增液至32 uL高纯水。
       为所有的样品制备充足的溶液。

    b) 将连接溶液从玻片上移去。
    c) 在室温下用1x 洗涤液A将玻片洗涤2x 2分钟。
    d) 在洗涤过程中,将聚合酶从冰柜中拿出并放置在冷冻模块中(-20°C)。
    e) 按1:80将聚合酶加入步骤(a)中的1x扩增液并混匀
       对于40 uL
    的扩增溶液,加入0.5 uL聚合酶至39.5 uL 1x扩增液。
    f)  将多余的洗涤液移去并加入扩增溶液。
    g) 根据不同的抗原修复方法(参考上面的注2),将玻片在湿润培养箱中37°C孵育90至120分钟。
  7. Duolink® 检测明场
    a) 将扩增溶液从玻片上移去。
    b) 在室温下用1x 洗涤液A将玻片洗涤2x 2分钟。
    c) 在洗涤过程中,用高纯水按1:5稀释5x检测明场储液并混匀。
       对于40 uL
    的反应,将8 uL的5x检测明场储液加入32 uL的高纯水中。
       为所有样品制备充足的溶液。

    d) 将多余的洗涤液移去并加入检测溶液。
    e) 玻片在湿润培养箱中室温孵育60分钟。
  8. 底物孵育
    注:酶与底物结合的孵育时间取决于蛋白表达的水平以及样品预处理的条件。因此,孵育时间需要由用户来决定,但通常在2-15分钟。

    a) 将检测溶液从玻片上移去。
    b) 在室温下用1x 洗涤液A将玻片洗涤2x 2分钟。
    c) 在洗涤过程中,用高纯水稀释底物试剂A(1:70)、B(1:100)、C(1:100)以及D(1:50)制备底物溶液。
       对于40 uL的反应,加入0.6 uL的底物A、0.4 uL的底物B、0.4 uL的底物C以及0.8 uL的底物D至37.8 uL的高纯水中。
       为所有样品制备充足的溶液。

    d) 将多余的洗涤液移去并加入底物溶液。
    e) 根据样品情况将玻片在室温条件下孵育适当的时间。
  9. 核染色剂
    a) 将底物溶液从玻片上移去。
    b) 在室温下用1x 洗涤液A将玻片洗涤2x 2分钟。
    c) 每1 cm2样品加入1滴(~40 uL)核染色剂。确保核染色剂覆盖整个样品。
    d) 将玻片室温孵育2分钟。
    e) 用流动的去离子水(非静态水)对玻片润洗10分钟。
  10. 脱水
    a) 将玻片在室温条件下用96%乙醇孵育2x 2分钟。
    b) 将玻片在室温条件下用99.7%乙醇孵育2x 2分钟。
    c) 将玻片在室温条件下用二甲苯孵育10分钟。
    d) 将玻片转移到新鲜的二甲苯中。
  11. 成像准备
    注:在使用随附的底物试剂时不要使用水相的封固剂。避免在盖玻片下混入气泡。
    a) 将多余的二甲苯移去。
    b) 用盖玻片以及最少体积的非水相IHC兼容封固剂,如用于组织学的DPX 封固剂,对玻片进行封片。
    c) 等待玻片充分干燥。
    d) 利用至少20x物镜的明场显微镜进行分析。
    e) 在进行成像后,将玻片储存在室温。PLA信号可稳定数年.

结果

图像采集

使用明场显微镜观察Duolink® PLA 明场实验的结果。 Duolink® PLA明场信号在被研究的细胞或组织样本的不同位置被识别为离散的红褐色斑点(图1A)。 蓝色是核复染剂。偶尔可以观察到弥散的浅棕色染色,这可能是未淬灭的内源性过氧化物活性所致。该染色也会存在于阴性对照(无一抗)样品中。真实的PLA信号具有亚微米的尺寸并会出现在多个焦平面中。因此,可通过改变焦距来“扫描”单个PLA信号,使其出现和消失。但在信号密度太高以至于聚集时,如在研究高表达蛋白时,这一点可能并不适用(图1B)。

 

Detection of HER2 receptor and HER2/HER3 heterodimers in FFPE breast cancer tissue

图1. 使用Duolink® PLA 明场检测FFPE乳腺癌组织中的HER2受体和HER2/HER3异二聚体。(A)使用经优化可产生单独PLA信号的HER2和HER3一抗进行Duolink® PLA检测,揭示HER2/HER3之间的相互作用。(B)仅使用HER2一抗进行Duolink® PLA检测。由Pantomics Inc.通过针对HER2的IHC而被评分为2+的丰富HER2受体引起了PLA信号的聚结。(C)阴性对照(无一抗)。PLA信号显示为红棕色点;核为蓝色

明场图像通常是在一个焦平面上拍摄。要减少失焦的PLA信号数量,请使用高数值孔径的物镜。重要的是在实验中样品之间需保持所有设置在光强度、曝光时间、阴影校正/白平衡等方面不变。应将光强度与曝光时间相结合一起设置以产生正确的曝光平衡。请参考Duolink® PLA故障排除指南获取如何防止信息聚结及其他方面优化的建议。


图像分析

可用于免疫组织化学的图像分析工具同样也可用于量化PLA信号。在确定阈值之后,可使用用于传统明场分析的软件,通过点强度测量或具有信号的样本分布面积来对图像数据进行最佳的分析。可获得每个图像的信号数和细胞数,通过平均测量或将每个单独的信号分配给特定的细胞用于单细胞分析。

 

故障排除

请参阅Duolink® PLA故障排除指南获取相应的提示、技巧、常用故障排除指南以及一系列常见问题解答(FAQ)。随时欢迎联系我们的技术支持团队(techserv@sial.com)或当地销售代表来为您的实验获取帮助。

 

定制服务

您的实验有无额外的定制需求? 我们将竭诚为您服务。欢迎了解我们的定制服务计划的更多信息,加速您的Duolink®PLA项目。

 

材料

     

  

参考文献

  • Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius KJ, Andersson AC, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, Östman A, Landegren U, Söderberg O. PLA detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor β using a generalized proximity ligation method. Molecular and Cellular Proteomics, 6, 1500-1509 (2007).
  • Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M , Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, and Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes PLA by proximity ligation. Nat Methods, 3, 995-1000 (2006).
  • Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, and Fredriksson S. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad Sci USA, 101, 8420‑24 (2004).
  • Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gustafsdottir SM, Östman A, and Landegren U. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol, 20, 473-77 (2002).