Duolink® PLA荧光实验方案

本实验方案描述了Duolink® PLA试剂用于组织和细胞样品中个体蛋白质、蛋白质修饰和蛋白质相互作用的免疫荧光检测、可视化和定量。如想了解Duolink® PLA技术,请下载我们的手册并查阅如何优化Duolink® 邻近连接测定以获得更多详细信息。有关其他实验方案,请参阅Duolink® PLA明场实验方案Duolink® PLA Probemaker用户指南

材料和设备

Duolink® PLA荧光实验方案

结果

故障排除

参考文献


 材料和设备

Duolink® PLA试剂

有关具体的产品建议,请参阅Duolink® PLA产品选择指南。简单来说,要运行用于荧光检测的Duolink® PLP实验,需要以下Duolink® PLA产品:

1. Duolink® PLA探针(一种PLUS和一种来自不同物种的MINUS,与您的一抗宿主物种相匹配)。每个试剂盒包括:
    a)PLA探针(5x)— PLUS和/或MINUS,取决于产品
    b)封闭溶液 — 用于在孵育抗体前封闭样品
    c)抗体稀释剂 — 用于稀释PLA探针,而且如果需要,用于稀释一抗

说明:将试剂盒的所有组分存放在4°C温度下。


说明:如果需要,可用Duolink® PLAProbemaker PLUS和/或Probemaker MINUS试剂盒生成定制的PLA探针。有关详细信息,请参阅Probemaker指南。

2. Duolink® 荧光检测试剂(可选择绿色橙色红色远红)。每个试剂盒包括:
    a)连接原液(5x)— 稀释以制备1x连接缓冲液
    b)连接酶(1 U/μl)— 添加以制备连接溶液
    c)扩增原液(5x)— 稀释以制备1x扩增缓冲液
    d)聚合酶(10 U/μl)— 添加以制备扩增溶液

说明:将所有组分存放在-20°C温度下。

3. 荧光用洗涤缓冲液(A和B)

4. 含DAPI的Duolink® 挂载培养基(用于载玻片,储存在2-8°C)或者核染色和防褪色剂(用于微孔板,储存在-20°C)

其他材料

1. 检测目标蛋白质的一抗。当与Duolink® PLA探针一起使用时,必须在小鼠、兔子或山羊中饲养。

2. 高纯度纯水(无菌过滤,Milli-Q® 或类似水质)

3. 载玻片上的样品(细胞或组织),已经过固定、恢复和透化方面的预处理。关于下列主题的相关建议和详细信息,请参阅如何优化Duolink® 邻近连接测定
    a)实验设计和对照
    b)选择一抗和优化
    c)样品处理

设备

  1. 荧光显微镜,带有适当的滤镜、相机和用于图像采集的软件
  2. 37°C培养箱
  3. 摇床
  4. 加热湿度箱或微孔板传热座
  5. 疏水笔,用于画出反应区域
  6. 冷冻座(用于酶)
  7. 染色罐
  8. 镊子
  9. 移液器和吸头(1 μl至1000 μl)
  10. 与荧光显微镜兼容的盖玻片


 Duolink® PLA荧光实验方案

以下实验方案适用于载玻片上的1cm2样品,需要40 μL溶液以充分覆盖。根据您的反应面积和样品数量调整体积。所有孵育均应在湿度箱中进行。所有洗涤步骤均应在室温下在染色罐中进行,罐中至少有70 ml缓冲液,并轻轻搅拌。

制备试剂

  1. 洗涤缓冲液A和B应在开始测定之前制备,将一小袋内容物溶解在高纯度纯水中,定容1000 mL。溶液可以短时间储存于室温下(少于两周)或者长期储存于在4℃下。说明:使用前将溶液升温至室温。
  2. 开始测定之前,用高纯度纯水以1:100稀释1x洗涤缓冲液B,制成0.01x洗涤缓冲液B
  3. 许多Duolink® PLA试剂以浓缩原液形式提供,在使用前立即稀释。请勿储存稀释后的Duolink® PLA试剂。

Duolink® PLA实验方案

在开始之前,将样品沉积在载玻片上,并经过固定、恢复和/或透化方面的预处理。有关详情,请参阅如何优化Duolink® 邻近连接测定

1. 封闭
    a)涡旋Duolink® 封闭液。
    b)在每个1cm2样品上添加1滴(~40 μL)Duolink® 封闭液。确保封闭液要覆盖整个样品。
    c)将载玻片置于加热湿度箱中37℃孵育60分钟。

2. 孵育一抗
    说明:在添加抗体之前请勿让载玻片干燥,否则会导致背景。

    a)涡旋Duolink® 抗体稀释剂。
    b)在Duolink® 抗体稀释剂中稀释一抗或抗体至合适浓度。
    c)从载玻片上弹掉Duolink® 封闭液
    d)将一抗溶液添加到每个样品中。
    e)将载玻片置于湿度箱中孵育。用最佳孵育温度和时间孵育一抗。

3. 孵育Duolink® PLA探针
    a)涡旋PLUS和MINUS PLA探针。
    b)在Duolink® 抗体稀释剂中以1:5稀释PLUS和MINUS PLA探针。
        对于40 μL反应,取8 μL PLA探针MINUS原液,8 μL PLA探针PLUS原液和24 μL抗体稀释剂。
为所有样品制备足量的溶  液。
    c)从载玻片弹掉一抗溶液。
    d)在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。
    e)弹掉多余的洗涤缓冲液,然后涂抹PLA探针溶液。
    f)将载玻片置于预热的湿度箱37℃孵育1小时。

4. 连接
    说明:连接酶要等到需要添加到样品中时立即添加。确保连接缓冲液在使用前完全解冻并充分混合。

    a)用高纯度纯水以1:5稀释5x Duolink® 连接缓冲液并混合。
         对于40 μL反应,将8 μL 5x连接缓冲液添加到32 μL高纯度纯水中。

         为所有样品制备足量的溶液。
    b)从载玻片弹掉PLA探针溶液。
    c)在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。
    d)在洗涤过程中,使用冷冻座(-20°C)恢复从冻箱里取出的连接酶。
    e)以1:40稀释度将连接酶添加到步骤(a)中的1x连接缓冲液中,并混合。
          对于40 μL连接溶液,将1 μL连接酶添加至39 μL的1x连接缓冲液中。
    e)弹掉多余的洗涤缓冲液,然后涂抹连接溶液。
    f)将载玻片置于预热的湿度箱37℃孵育30分钟。

5.扩增
    说明:聚合酶要等到需要添加到样品中时立即添加。扩增缓冲液对光敏感。避免所有含有扩增缓冲液的溶液受到光   照。

    a)用高纯度纯水将5x扩增缓冲液以1:5稀释并混合。
        对于40 μL反应,将8 μL 5x扩增缓冲液添加到32 μL高纯度纯水中。

        为所有样品制备足量的溶液。
    b)从载玻片弹掉连接溶液。
    c)在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。
    d)在洗涤过程中,使用冷冻座(-20°C)恢复从冻箱里取出的聚合酶。
    e)以1:80稀释度将聚合酶添加到步骤(a)中的1x扩增缓冲液中,并混合。
         对于40 μL扩增溶液,将0.5 μL聚合酶添加至39.5 μL的1x扩增缓冲液中。
    f)弹掉多余的洗涤缓冲液,然后涂抹扩增溶液。
    g)将载玻片置于预热的湿度箱37℃孵育100分钟。

6. 最终洗涤
    说明:光敏试剂。始终避免保存载玻片。

    a)从载玻片上弹掉扩增溶液。
    b)在室温下在1x洗涤缓冲液B中将载玻片洗涤2x 10分钟。
    c)在0.01x洗涤缓冲液B中洗涤载玻片1分钟。

7. 准备成像
    说明:
含DAPI的Duolink® 原位挂载培养基是水性的,不会凝固。可以使用透明指甲油将盖玻片的边缘密封到载玻片 
  上。避免盖玻片下面夹带气泡。

    a)从载玻片上弹掉多余的洗涤缓冲液。
    b)使用最小体积的含DAPI的Duolink® 原位挂载培养基,用盖玻片盖好载玻片。
    c)   等待15分钟,然后在荧光或共聚焦显微镜中分析,使用至少20x物镜。
    d)成像后,可将载玻片在黑暗中4°C下保存最多4天,或者在-20°C下保存最多6个月


 结果

图像采集

Duolink® PLA实验的结果通常使用荧光显微镜观察,用适当的滤镜检测荧光团。Duolink® PLA信号被认为是被研究的细胞的不同位置上的离散荧光点(见图1A)。单个信号具有亚微米尺寸并且可以在多个焦平面中。因此,可能需要在整个样品厚度上获得图像。然而,只要要比较的所有图像都来自于样本内的类似位置,就可以仅在一个平面中获取图像。值得注意的是,常在技术阴性对照(例如没有一抗的对照,参见图1B)中检测到一些信号。然而,如果每十个细胞获得超过一个或两个信号,则可能需要进一步滴定一抗。

使用Duolink® PLA检测A431细胞的细胞离心涂片中的EGFR。图片显示了基于20个z平面的原始图像的最大强度投影。PLA信号显示为红色,核显示为蓝色。核图像是在一个z平面中获得。A)阳性反应。B)没有一抗的阴性对照。

图1. 使用Duolink® PLA检测A431细胞的细胞离心涂片中的EGFR。图片显示了基于20个z平面的原始图像的最大强度投影。PLA信号显示为红色,核显示为蓝色。核图像是在一个z平面中获得。A)阳性反应。B)没有一抗的阴性对照。

重要的是使用相同的设置(曝光时间、增益、使用的滤镜等)来捕获实验中的所有图像。可以使用阳性和阴性对照来优化设置。如果PLA信号的数量很大,PLA信号会融合/结合在一起(参见图2)。这种情况会发生在研究高度表达的蛋白质时,或者过度曝光的图像捕捉过程中。在设置图像采集时,必须小心设置,以获得个体PLA信号。关于如何防止信号融合以及关于其他可能的优化方面,请参阅Duolink® PLA故障排除指南

使用Duolink® PLA检测SKBR-3高表达细胞的FFPE制剂中的Her2。图片显示了基于20个z平面的原始图像的最大强度投影。PLA信号显示为红色,核显示为蓝色。核图像是在一个z平面中获得。A)阳性反应。B)没有一抗的阴性对照。

图2. 使用Duolink® PLA检测SKBR-3高表达细胞的FFPE制剂中的Her2。图片显示了基于20个z平面的原始图像的最大强度投影。PLA信号显示为红色,核显示为蓝色。核图像是在一个z平面中获得。A)阳性反应。B)没有一抗的阴性对照。
 

图像分析

现在有几种图像分析工具可用于量化PLA信号。可以对图像数据进行分析得到每个细胞或细胞内每个区域的PLA信号的平均荧光强度和/或PLA信号总数(参见图3)。报告的定量数据是给定实验中相对于技术和/或生物对照的数据。然而,只有在PLA信号未融合并且图像像素未饱和的情况下,才可能进行可靠的量化。

使用成像软件进行图像分析。自动检测了DAPI染色的细胞核(蓝色),并由用户估计了细胞质大小(绿色轮廓)。PLA信号以红色显示,代表目标蛋白质靶标。用白色圆圈标记的PLA信号和轮廓用黄色勾勒出的核均在分析过程中进行了量化。

图3. 使用成像软件进行图像分析。自动检测了DAPI染色的细胞核(蓝色),并由用户估计了细胞质大小(绿色轮廓)。PLA信号以红色显示,代表目标蛋白质靶标。用白色圆圈标记的PLA信号和轮廓用黄色勾勒出的核均在分析过程中进行了量化。


 故障排除

请参阅Duolink® PLA故障排除指南查找故障排除的提示和技巧、一般故障排除说明、以及常见问题解答。

请随时联系我们的技术支持团队(techserv@sial.com)或当地销售代表以获得实验方面的帮助。


 定制服务

您的实验是否需要额外的定制?让我们为您完成这项工作。请详细了解我们的定制服务计划,以加速您的Duolink® PLA项目。


 材料

     


 参考文献

  1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius KJ, Andersson AC, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, Östman A, Landegren U, Söderberg O. PLA detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor β using a generalized proximity ligation method. Molecular and Cellular Proteomics, 6, 1500-1509 (2007).
  2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M , Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, and Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes PLA by proximity ligation. Nat Methods, 3, 995-1000 (2006).
  3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, and Fredriksson S. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad Sci USA, 101, 8420‑24 (2004).
  4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gustafsdottir SM, Östman A, and Landegren U. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol, 20, 473-77 (2002).