Duolink® PLA Probemaker指南

本指南详述了使用Duolink®原位Probemaker将PLA寡核苷酸(PLUS或MINUS)与任意抗体结合,进行Duolink®PLA实验的应用。只要使用PLUS PLA探针和MINUS PLA探针,Probemaker生成的PLA抗体即可与标准Duolink®PLA探针组合使用或独立使用。想了解有关Probemaker应用的更多信息,请访问故障排除指南中的创建自定义PLA®探针和Duolink® probemaker部分。

若想熟悉Duolink®PLA技术,请下载我们的手册并查看如何优化Duolink®邻位连接检测以获取更多详细信息。Duolink®PLA实验方案和关于使用Probemaker生成的PLA抗体所需的其他Duolink®PLA试剂的信息,可在Duolink® 资源中心查找。

 

应用

Duolink®Probemaker适用于不能或不宜单独使用现有Duolink®PLA探针的情况。本部分详述了Duolink®Probemaker的常见应用。

1.使用来自同一物种的一抗

使用来自同一物种的两种一抗时,可以使用Duolink®Probemaker将其中一种抗体与PLA PLUS寡核苷酸偶联,另一种抗体与PLA MINUS寡核苷酸偶联。仅使用直接偶联的一抗时,无需二抗或Duolink®PLA探针,并且应在PLA实验方案中略去该步骤。


Use of Primary Antibodies from the Same Species

2. 使用来自任意物种的一抗

目前的Duolink®PLA探针产品是PLA偶联二抗,可识别小鼠、兔或山羊的IgG。使用来自小鼠、兔或山羊以外的物种的两种一抗时,Duolink®Probemaker可用于标记一抗或带有PLA寡核苷酸的相应二抗。将其中一种抗体与PLA PLUS寡核苷酸偶联,另一种抗体与PLA MINUS寡核苷酸偶联。

Use of Primary Antibodies from any Species

仅有一种一抗来自小鼠、兔或山羊以外的物种时,只要使用PLUS PLA探针和MINUS PLA探针,即可使用Duolink®Probemaker生成的PLA抗体和标准Duolink®PLA探针的组合。

Use of Primary Antibodies from any Species

 

3. 使用来自同一物种的一抗体作为组织样品(例如,“小鼠抗小鼠”)

使用源自小鼠的一抗染色小鼠组织,通常会因二抗与被染色组织中的内源性小鼠IgG,以及B细胞、浆细胞和巨噬细胞上的Fc受体结合产生的高背景。为了避免使用抗小鼠二抗并降低背景,可以使用Duolink®Probemaker将来源于小鼠的一抗与PLA寡核苷酸直接偶联。

 

Use of Primary Antibody Derived from the Same Species as Tissue Sample

材料和设备

Duolink®Probemaker试剂

请参阅Duolink® PLA 产品选择指南有关具体的产品建议。Duolink®Probemaker支持您创建自定义PLA寡核苷酸偶联抗体,只要使用PLUS PLA探针和MINUS PLA探针,即可与标准Duolink®PLA探针组合使用或独立使用。每个Duolink®PLA Probemaker试剂盒都包含可在浓度为1 mg / mL时偶联20μg抗体的试剂。所含试剂如下:

a)  Duolink® PLA寡核苷酸 —1管冻干的活化寡核苷酸(PLUS或MINUS)

b) 偶联缓冲液 –用于缓冲偶联反应

c) 终止试剂 – 终止偶联反应

d) 储存溶液 — 用于保存偶联抗体(PLA探针)

e) 20x检测试剂 – 必要时可添加到实验者优化的抗体稀释剂中

f) 封闭溶液 – 用于在一抗孵育前阻断样品

g) PLA探针稀释剂 – 用于将偶联的抗体(PLA探针)稀释至最终测定浓度

注:所有试剂储-20°C储存。抗体偶联后, 4°C储存。

 

其他材料

1.一抗或二抗 — 用于与PLA寡核苷酸(PLUS和/或MINUS)偶联。参与偶联的抗体必须符合以下标准:

a) 待偶联的抗体必须具有1mg / mL的浓度。每次偶联需要20 µg (=20 µL)抗体。

注:如果使用单克隆抗体,则必须经过蛋白A或蛋白G亲和纯化。

b) 抗体必须置于无胺缓冲液中,最好是PBS。缓冲液应该不含载体和防腐剂,但可含有高达0.1%的BSA,5%的海藻糖和0.02%的叠氮化钠。

注:如果储存抗体的缓冲液成分未知,建议在偶联前进行透析或缓冲液置换。

注:不建议在Duolink®原位Probemaker偶联之前浓缩非常稀释的抗体,除非抗体量很大,因为过滤型浓缩器的抗体损失非常高。

2. 1x PBS – 根据需要进行抗体缓冲液置换。建议的缓冲置换操作步骤如下:

注:此步骤不适用于降低高浓度的BSA或其他大分子。              

1.首先3000rpm离心柱1分钟,用1x PBS预平衡离心柱,然后加入400μL的1x PBS并再次离心1分钟并重复4次。将离心柱放入新的微量离心管中。

2.将抗体(12-50μL)加入柱中, 3000 rpm离心2 min。通过吸光度检验收集的抗体的浓度。1 mg / mL抗体的吸光度在OD 280处应为1.4。

注:最好采用Microcon-10离心过滤装置((MilliporeSigma, MRCPRT010)。

 

Duolink® PLA Probemaker 偶联方案

本偶联方案详述了如何将PLA寡核苷酸(PLUS或MINUS)与任意抗体偶联。首先,请确定待偶联抗体置于无胺缓冲液中,浓度为1 mg / mL。抗体缓冲液应不含载体和防腐剂,但可含有高达0.1%的BSA、5%的海藻糖和0.02%的叠氮化钠。使用前将所有液体试剂涡旋。

1.  将2μL偶联缓冲液加入20μL待偶联的抗体中。抗体浓度应为1 mg / mL。

2.  轻轻吹打混匀。

3.  将抗体溶液转移至1瓶冻干寡核苷酸(PLUS或MINUS)中。

注:打开装有冻干寡核苷酸的样品瓶后立即加入抗体溶液。

4.  轻轻吹打混匀。

5.  室温下孵育过夜。

6.  向反应中加入2μL终止试剂。

7.  在室温下孵育30分钟。

8.  根据需要加入24μL储存溶液,或加入其他试剂以稳定特异性抗体。

9.  稳定之后,PLA探针可以在4°C下储存于储存溶液中。

 

Duolink® PLA 检测实验方案

只要使用PLUS PLA-偶联的抗体和MINUS PLA-偶联的抗体, Duolink® PLA荧光实验方案或 Duolink® PLA 明场实验方案既可用与Probemaker生成的抗体、标准Duolink®PLA探针结合使用或独立使用。请注意以下基于PLA探针的可能对实验产生影响的变更:

1.  Probemaker试剂盒中的PLA探针稀释剂应作为荧光和明场实验方案中Duolink®抗体稀释剂的替代品。

2.  可选:当使用自定义抗体稀释剂代替提供的PLA探针稀释剂时,建议在使用PLA-偶联抗体之前,将20x检测试剂按照1:20稀释于自定义的抗体稀释剂中。

3.  在荧光和明场实验方案的适当步骤孵育PLA偶联的抗体。如果使用一抗偶联,则在一抗孵育步骤(荧光,步骤2;明场,步骤3)期间使用。如果使用二抗进行偶联,则在PLA探针孵育步骤(荧光,步骤3;明场,步骤4)期间使用。

4.  仅使用直接偶联的一抗时,无需二抗或Duolink®PLA探针。因此,跳过荧光(步骤3)和明场(步骤4)实验方案中的PLA探针孵育步骤。对于PLA探针的任何其他组合,可直接按照实验方案操作。

 

故障排除

请参阅Duolink® PLA故障排除指南获取相应的提示、技巧、常用故障排除指南以及一系列常见问题解答(FAQs)。

随时欢迎联系我们的技术支持团队(techserv@sial.com)或当地销售代表来为您的实验获取帮助。

 

定制服务

您的实验是否有额外的定制需求? 我们将竭诚为您服务。欢迎了解我们的定制服务计划的更多信息,加速您的Duolink®PLA项目。

 

参考文献

  1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius KJ, Andersson AC, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, Östman A, Landegren U, Söderberg O. PLA detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor β using a generalized proximity ligation method. Molecular and Cellular Proteomics, 6, 1500-1509 (2007).
  2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M , Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, and Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes PLA by proximity ligation. Nat Methods, 3, 995-1000 (2006).
  3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, and Fredriksson S. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad Sci USA, 101, 8420‑24 (2004).
  4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gustafsdottir SM, Östman A, and Landegren U. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol, 20, 473-77 (2002).