ELISA 方案


 夹心测定程序

  1. 使用前将所有试剂和样品调至室温 (18-25°C)。建议所有标准品和样品至少准备一式两份。
  2. 每个标准加入 100μl 样品到适当的孔中。盖上孔,室温培养 2.5 小时,或 4℃ 温和振荡过夜。
  3. 弃去溶液,用 1 倍洗涤液洗 4 次。用多通道移液器或自动进样器和洗涤缓冲液 (300μl) 注入、洗涤每个孔。在每个步骤中完全去除液体对于获得良好的性能是必不可少的。在最后一次清洗后,通过抽吸或倾析除去任何剩余的清洗缓冲液。翻转孔板,用干净的纸巾上吸干。
  4. 每孔加入 100μl 1x 制备的检测抗体。盖上盖子,室温温和振荡培养 1 小时。
  5. 弃去溶液。重复步骤 3 中的清洗程序。
  6. 每孔加入 100μl 制备好的链霉亲和素溶液。盖上盖子,室温温和振荡培养 45 min。
  7. 弃去溶液。按照步骤 3 重复清洗。
  8. 每孔加入 100μl TMB 一步式基质试剂(H 项)。盖上盖子,在室温下避光温和振荡培养 30 min。
  9. 每孔加入 50μl 终止液(I 项)。立即读取 450 nm 处的吸光度。

 

夹心测定程序

 

 


 磷酸化测定程序

  1. 使用前将所有试剂调至室温 (18-25°C)。建议所有样本或阳性对照至少准备一式两份。
  2. 每个样品或阳性对照加入 100μl 到适当的孔中。用持板器盖上盖子,室温培养 2.5 小时或 4℃ 振荡过夜。
  3. 弃去溶液,用 1 倍洗涤液洗 4 次。用多通道移液器或自动进样器和洗涤缓冲液 (300μl) 注入、洗涤每个孔。在每个步骤中完全去除液体对于获得良好的性能是必不可少的。最后一次清洗后,吸出所有剩余的清洗缓冲液。翻转孔板,用干净的纸巾上吸干。
  4. 每孔加入 100μl 制备好的 1X 生物素化抗磷酸酪氨酸抗体。室温振荡培养 1 小时。
  5. 弃去溶液。按照步骤 3 重复清洗。
  6. 每孔加入 100μl 配制好的 1X HRP-链霉亲和素溶液(见试剂配制步骤 6)。室温振荡培养 45 min。
  7. 弃去溶液。按照步骤 3 重复清洗。
  8. 每孔加入 100μl TMB 一步式基质试剂(H 项)。室温避光,振荡培养 30 min。
  9. 每孔加入 50μl 终止液(I 项)。在 450 nm 处立即读取

磷酸化测定程序

 


 EIA 测定程序

  1. 试剂准备步骤中,将试剂盒试剂保存在冰上。建议所有标准品和样品至少准备一式两份。
  2. 每孔加入 100μl 抗“靶”抗体。室温温育 1.5 小时,轻轻摇动(1-2 次/秒)。也可以在 4°C 培养过夜。
  3. 弃去溶液,用 1 倍洗涤缓冲液(各 200-300μl)洗孔 4 次,可用多道移液器或自动洗板机清洗。在每个步骤中完全去除液体对于良好的测定性能至关重要。在最后一次清洗后,通过抽吸或倾析除去任何剩余的清洗缓冲液。翻转孔板,用干净的纸巾上吸干。
  4. 将各标准品、阳性对照品和样品各 100μl 加入适当的孔中。确保包括一个空白孔(仅限检测稀释液)。盖上孔,室温温和振荡(1-2 次/秒) 2.5 小时或 4°C 过夜培养。
  5. 弃去溶液,按照步骤 3 的说明洗 4 次。
  6. 每孔加入 100μl 制备好的 HRP-链霉亲和素溶液。室温温和振荡培养 45 min。建议培养时间不要短于或长于 45 min
  7. 弃去溶液,按照步骤 3 的说明洗 4 次。
  8. 每孔加入 100μl TMB 一步式基质试剂(H 项)。室温避光培养 30 min,轻轻摇动(1-2 次/秒)。
  9. 每孔加终止液(I 项)50μl。立即读取 450 nm 处的吸光度。

 

EIA 测定程序


 

 


 基于细胞的检测程序

注:所有培养和洗涤步骤必须在轻轻摇动或旋转(~1 - 2 周期/秒)状态下进行。
 

  1. 设计你的实验。
    可选项:如果接种 HUVEC、HMEC‐1 或其他松散附着的细胞,通过加入 100μl 聚 L 赖氨酸(推荐的 Sigma-Aldrich 产品编号:P4832)到每个孔中的方式涂布 96 孔微孔板(A 项),然后按照制造商的说明操作。可用预 包被的 CellBIND®  微孔板或其他聚赖氨酸处理的组织培养板代替 A 项。
  2. 向未包被的 96 - 微孔板(A 项)的每个孔中加入 100μl 10,000 至 30,000 个细胞,并在 37°C 和 5%CO2 下培养过夜。
    注:所使用的最佳细胞数在细胞系和蛋白质磷酸化的相对量上会有所不同。可以使用或多或少的细胞,但必须凭经验确定。注:在用抑制剂或激活剂处理之前,细胞可以饥饿 ~4 - 24 小时(取决于细胞系)。
  3. 根据制造商的说明应用各种治疗、抑制剂(如 siRNA 或化学品)或激活剂,并培养所需的时间点。
    注:建议在处理细胞前将抑制剂或激活剂溶解于无血清的细胞培养基中(除非制造商说明书中另有说明)。  
  4. 倒置微孔板,轻轻敲打微孔板底部的水槽,弃去细胞培养基。    
  5. 吸取 200μl 准备好的 1 倍洗涤缓冲液 A (B 项)到每个孔中进行洗涤。弃去洗涤缓冲液(步骤 4 相同),每次再用新鲜洗涤缓冲液洗涤 2 次,共洗涤 3 次。最后一次洗涤后,用纸巾轻轻吸干微孔板,除去多余/残留的缓冲液。
    注:为避免细胞丢失,请勿直接移液到细胞上。应将液体轻轻地倒向细胞培养孔壁。弃去任何溶液时,也应避免使用真空抽吸或用很大的力敲击微孔板。
  6. 每孔加定影液(项目 D)100μl,室温培养 20 min。
    注:固定液用于透化细胞。
  7. 重复洗涤步骤 5。 
  8. 每孔加入 200μl 准备好的 1X 淬灭缓冲液(E 项),室温培养 20 min。
    注:淬灭缓冲器用于最小化背景响应。
  9. 用 1 倍洗涤缓冲液 A 洗 4 次。
  10. 每孔加入 200μl 制备好的 1X 封闭缓冲液(F 项),37℃ 培养 1 小时。
  11. 用准备好的 1X 洗涤缓冲液 B(C 项)洗涤 3 次。
    注:如果需要,在洗涤后,微孔板可在 – 80°C 下保存数天。
  12. 向每个相应的孔中加入 50μl 制备的 1X 第一抗体(G‐1, G‐2, G‐3, H‐ 1, H‐2 或 H‐3项),室温培养 2 小时。
  13. 用 1 倍洗涤缓冲液 B 洗 4 次。
  14. 每孔加入 50μl 制备好的 1X HRP 偶联二抗(I-2 项),室温培养 1 小时。
  15. 重复步骤 13。
  16. 每孔加入 100μl TMB 底物(J 项),室温避光培养 30 min。
  17. 每孔加入终止液 50μl(K 项)。立即读取 450 nm 处的读数。

 

基于细胞的检测程序

 

 




这些实验方案仅用作参考。有关具体说明,请参阅每个试剂盒的详细技术公告。