5'-核苷酸酶的酶促检测

1. 目标

标准化5'-核苷酸酶的酶活性测定方法。

 

2. 适用范围

此方法适用于所有含有5'-核苷酸酶组分的产品,不可用于测定来自牛肝的5'-核苷酸酶(Sigma-Aldrich货号N2779),或来自东部菱背响尾蛇不溶性的5'-核苷酸酶(Sigma-Aldrich货号N3264)或5'-核苷酸酶作为杂质的样品。

 

3. 定义

3.1 纯水=来自去离子系统的水,25ºC条件下电阻率>或=18MΩ•cm

3.2 活力单位定义=一个活力单位能在pH 9.0,37℃条件下,每分钟从腺苷5'-一磷酸中水解出1.0微摩尔的无机磷。

3.3 STD = 磷标准品

3.4 5-AMP = 腺苷5'-单磷酸。

3.5 Pi = 无机磷酸盐

3.6 TSCR = Taussky-Shorr 显色剂

 

4. 讨论

5-AMP + H2O    5'- 核苷酸酶   > 腺苷 + Pi

 

5. 责任

经过培训的分析服务实验室人员有责任按照书面规定执行此程序。

 

6. 安全

有关危险和适当的操作注意事项,请参阅安全数据表(SDS)。

 

7. 步骤

7.1 条件:
T = 37°C, pH = 9, A660nm, Light path = 1 cm

7.2 方法:
分光光度法停止反应

7.3 试剂:

7.3.1    200mM甘氨酸缓冲液,pH 9.0,37℃(缓冲液):利用纯水制备15.0mg / ml甘氨酸(Sigma-Aldrich货号G7126)溶液。 调节至pH 9.0。

7.3.2    66 mM腺苷5'-单磷酸盐溶液(5'-AMP)

7.3.2.1    利用纯水制备22.9mg / ml来自酵母的5'-一磷酸腺苷钠盐( Sigma-Aldrich货号A1752)溶液。

7.3.2.2    通过高压液相色谱测定水百分比、钠百分比和纯度百分比,以校正腺苷5'-单磷酸盐浓度。

7.3.3    200 mM硫酸镁溶液(MgSO4)。利用纯水制备49.3mg / ml硫酸镁七水合物(Sigma-Aldrich货号M1880)溶液。 

7.3.4     磷标准品(STD):0.645 μ moles / ml的磷标准溶液(Sigma-Aldrich货号P3869)。 

7.3.5    10N硫酸溶液(H2SO4):在冰纯净水种制备0.278 ml/ml的硫酸(95-98%,A.C.S.级试剂;Sigma-Aldrich货号258105) 

7.3.6    10%(w/v)钼酸铵溶液 [(NH4)6MO7O24]

7.3.6.1    在7.3.5的硫酸溶液中,使用钼酸铵四水合物(Sigma-Aldrich货号A7302)制备100mg / ml的溶液。这一过程可能需要超过8小时的搅拌才能溶解。 

7.3.6.2    如果没有产品Sigma-Aldrich A7302,可以使用钼酸铵四水合物(Sigma-Aldrich产品编号M0878)作为替代品。 

7.3.6.3    10%(w/v)钼酸铵溶液在室温、黑暗条件下可稳定6个月。

7.3.7    Taussky-Shorr显色剂(TSCR)

7.3.7.1    通过将10ml试剂7.3.6 [(NH4)6MO7O24]加入70ml纯水中制备100ml。

7.3.7.2    然后加入5克硫酸亚铁七水合物(Sigma-Aldrich货号F7002)。 

7.3.7.3    混合至溶解,用纯水稀释至终体积100ml。

7.3.8    5'-核苷酸酶溶液(酶)

7.3.8.1    在使用前,在冷纯水中制备含约100单位/ ml的溶液,并旋转至溶解。

7.3.8.2    立即将试剂7.3.8.1在冷纯水中稀释至40-60单位/ ml。每次进行检测都需要进行新鲜稀释。

7.4 实验步骤

7.4.1    检测-1

7.4.1.1    将下列试剂移入(以毫升计)合适的容器中:

  测试-1 测试-2 空白-1
试剂7.3.1(缓冲液) 1.50 1.50 1.50
纯净水 0.24 0.24 0.24
试剂7.3.3(MgSO4 0.10 0.10 0.10
试剂7.3.2(5-AMP 0.15 0.15 0.15

 

7.4.1.2    通过旋转混合并平衡至37℃。 然后加:

试剂
7.3.8 ()
0.005 0.005 -----

 

7.4.1.3    通过旋转混合并在37℃下将Test-1孵育1.0分钟,并将Test-2孵育恰好2.0分钟。 然后加:

试剂7.3.7(TSCR) 4.00 4.00 4.00
试剂7.3.8() ----- ----- 0.005
纯水

 

2.00 2.00 2.00

 

7.4.1.4 倒置混合并在室温下孵育5分钟。转移到合适的比色皿中,使用合适的分光光度计测量/记录A660nm用于Test-1,Test-2和Blank-1与纯化水。

7.4.1.5 如果结果不一致,则重复步骤7.4.1.1至7.4.1.4。

7.4.2    Assay-2

7.4.2.1 将下列试剂移入(以毫升计)合适的容器中:

  测试-3 测试-4 空白-2
试剂 7.3.1 (缓冲液)

 

1.50 1.50 1.50
纯水 0.24 0.24 0.24
试剂 7.3.3 (MgSO4)

 

0.10 0.10 0.10

试剂 7.3.2 (5-AMP)

0.15 0.15 0.15

 

7.4.2.2    旋转混合并平衡至37℃。 然后加入:

试剂7.3.8 () 0.010 0.010 -----

 

7.4.2.3    旋转混合并在37℃下将Test-1孵育1.0分钟,将Test-2孵育2.0分钟。 然后加入:

试剂7.3.7 (TSCR) 4.00 4.00 4.00
试剂7.3.8 () ----- ----- 0.010

纯水

2.00 2.00 2.00

 

7.4.2.4 颠倒混匀颠倒混匀并在室温下孵育5分钟。转移至合适的比色皿中,使用合适的分光光度计测量/记录,与纯化水比较,测试-3、测试-4和空白-2的A660nm值。

7.4.2.5 如果结果不一致,则重复步骤7.4.2.1至7.4.2.4。

7.5 标准曲线:

7.5.1 通过将下列试剂移液(以毫升计)至带有通气盖的合适容器中,制成标准曲线:

  标准品 1 标准品 2 标准品 3 标准品 4 标准品 5 标准品6 标准品7 标准空白
试剂7.3.4(STD) 0.05 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 2.00 -----
纯水 3.95 3.80 3.60 3.40 3.20 3.00 2.00 4.00
试剂7.3.7(TSCR) 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00


7.5.2    颠倒混匀并在室温下孵育5分钟。转移至合适的比色皿,使用合适的分光光度计测量/记录,与纯水比较标准品和标准空白的A660nm值。

7.6 计算

7.6.1    标准曲线

ΔA660nm标准品= A660nm标准品 - A660nm标准空白


    绘制标准品的ΔA660nm相对磷的的关系图。计算并记录斜率、y轴截距和线性回归(r2)。


7.6.2    样品测定

ΔA660nm样品= A660nm测试-1或测试-2 - A660nm测试空白-1

ΔA660nm样品= A660nm测试-3或测试-4 - A660nm测试空白-2

使用标准曲线确定释放的磷的微摩尔量。

单位/ml 酶  = (释放磷的微摩尔量)(df)
(0.5)(10)(2.5)

 

df =稀释系数

     0.005 =使用的酶的体积(以毫升计)或  0.010 =使用的酶的体积(以毫升计)

     T =每活力单位定义的测定时间(以分钟计)

单位/mg 固体 = 单位/mL 酶
固体/mL 酶

 

单位/mg蛋白质 = 单位/mL 酶
蛋白质/mL酶

 

7.7 最终检测浓度:

在2.00 ml反应混合物中,终浓度为150 mM甘氨酸、10 mM硫酸镁、5.0mM腺苷5'-单磷酸和0.2-0.6单位的5'-核苷酸酶。

 

8. 参考文献和附件

Heppel, P. A. and Hilmoe, R. J. (1951) Journal of Biological Chemistry 188, 665-676.

 

9. 批准

本文档将采用DocCompliance (QUMAS)生成的电子审核、批准和签名。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“供使用”副本。

 

材料