α-淀粉酶酶促测定 (EC 3.2.1.1)


 描述

本操作规程可以用来测定α-淀粉酶的活性。

分光光度停止反应测定法(A540,光程 = 1 cm)基于以下反应:

单位定义:一个单位是指在pH 6.9、20℃下,淀粉在3分钟内释放1.0 mg麦芽糖。


 需要的试剂和设备

磷酸钠,一元,产品编号:S0751

氯化钠,产品编号:S9888

马铃薯淀粉,产品编号:S2004

氢氧化钠,产品编号:S5881

酒石酸钾钠,四水化合物,产品编号:S2377

3,5-二硝基水杨酸,产品编号:D0550

D(+)麦芽糖,一水化合物,产品编号:M9171

 

注意事项 

有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。


 制备说明

使用超纯水(25°C时电阻率 ≥ 18 MΩ×cm)制备试剂。

缓冲液(20 °C,20 mM磷酸钠与6.7 mM氯化钠,pH 6.9)— 用超纯水制备含有2.4 mg/mL 磷酸钠一元(产品编号:S0751)、和0.39 mg/mL氯化钠(产品编号:S9888)的溶液。在20 °C,用1 M NaOH / 1 M HCl将pH值调节为6.9。

淀粉溶液 [1.0% (w/v) 可溶性淀粉溶液] — 用缓冲液和马铃薯淀粉(产品编号:S2004)制备10 mg/mL的溶液:

  • 在加热 / 搅拌器上,边搅拌边加热至沸腾15分钟使溶液完全溶解。

  • 从加热 / 搅拌器上取下来。继续搅拌该溶液直到降至室温。

  • 用超纯水将溶液定容。

  • 在整个测定程序中持续搅拌溶液。

2 M氢氧化钠(NaOH)溶液 — 用超纯水和氢氧化钠(产品编号:S5881)制备80 mg/mL的溶液。 

5.3 M酒石酸钾钠四水化合物溶液 — 用2 M氢氧化钠(NaOH)溶液和酒石酸钾钠四水化合物(产品编号:S2377)制备1,496 mg/mL的溶液。将溶液放在加热 / 搅拌器上,边搅拌边加热使固体物质溶解。请勿加热至沸腾!

96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液 — 用超纯水和3,5二硝基水杨酸(产品编号:D0550)制备21.9 mg/mL的溶液。将溶液放在加热 / 搅拌器上,边搅拌边加热使固体物质溶解。请勿加热至沸腾!

显色剂溶液 — 制备40 mL:

  • 将12.0 mL 温热(50–70 °C)超纯水添加至大小合适的琥珀色瓶子里。 
    边搅拌边慢慢添加:
  • 8.0 mL温热的5.3 M酒石酸钾钠四水化合物溶液
  • 20.0 mL温热的96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液

该溶液在室温避光条件下可以保持稳定6个月。可以视需要调整制备的体积。

0.2% (w/v) 麦芽糖标准溶液 — 在容量瓶里用超纯水和D(+)麦芽糖一水化合物(产品编号:M9171)制备2 mg/mL的溶液。

α-淀粉酶样品溶液 — 20 °C下用超纯水制备含有0.751.5 个单位/mL α-淀粉酶的溶液,制备完成后立即使用。


 操作步骤

最终测定浓度 — 在2.00 mL反应休积中,最终浓度为0.50% (w/v) 淀粉和约1个单位的α-淀粉酶。

1. α-淀粉酶样品测定

a. 用移液枪 (mL) 将以下试剂转移到合适的容器中:
 

试剂 样品1 样品2 样品3  空白样品
淀粉溶液 1.00 1.00  1.00 1.00


b. 涡旋搅拌均匀并平衡至20 °C。然后添加(mL):
 

试剂 样品1 样品2 样品3  空白样品
α-淀粉酶样品 0.50
0.70
1.00 -


c. 涡旋搅拌,然后在20 °C下刚好孵育3.0分钟。然后添加:
 

试剂 样品1 样品2 样品3  空白样品
显色剂 1.00 1.00  1.00 1.00


d. 用可以排气的盖子盖好容器,放入沸水浴刚好15分钟。
 

e. 从沸水浴中取出容器。然后添加(mL):
 

试剂 样品1 样品2 样品3  空白样品
α-淀粉酶样品 0.50 0.30 - 1.00


f. 在冰上使溶液降至室温。


g. 然后添加(mL):
 

试剂 样品1 样品2 样品3  空白样品
超纯水 9.00 9.00 9.00 9.00


h. 倒置混合。将合适的分光光度仪在540nm以空气归零,并记录样品和空白样品的A540读数。

2. 作标准曲线

a. 用移液枪(mL)将以下试剂移入合适的容器,以作出标准曲线:
 

试剂 标样1 标样2 标样3  标样4 标样5 标样6 标样7  空白标样
0.2% (w/v) 麦芽糖标准溶液 0.05 0.20  0.40 0.60 0.80 1.00  2.00
超纯水 1.95  1.80 1.60 1.40 1.20  1.00 2.00
显色剂  1.00 1.00 1.00 1.00  1.00 1.00 1.00 1.00 


注释:可以视需要添加更多的标准溶液。

b. 用可以排气的盖子盖好容器,放入沸水浴刚好15分钟。

c. 从沸水浴中取出容器。在冰上使溶液降至室温。

d. 然后添加(mL):
 

试剂 标样1 标样2 标样3  标样4 标样5 标样6 标样7  空白标样
超纯水 9.00 9.00  9.00 9.00 9.00 9.00  9.00 9.00

e. 倒置混合。将合适的分光光度仪在540nm以空气归零,并记录标样和空白标样的A540读数。


 结果

计算

  1. 确定每个标样 和空白标样之间的差值ΔA540。  
    ΔA540 (标样) = A540 (标样) – A540 (空白标样)
  2. 用线性回归法制作标准曲线,即绘制标样ΔA540 与麦芽糖mg数的关系曲线。
  3. 确定每个样品 和空白样品之间的差值ΔA540。  
    ΔA540 (样品) = A540 (样品) – A540 (空白样品)
  4. 用标准曲线确定释放的麦芽糖mg数。

  5.     


    式中: 
    df = 稀释倍数 
    mL酶 = 在步骤1b中加入的样品mL量。
  6.     


 材料

     


 参考文献

  1. Bernfeld, P., Methods in Enzymology, 1, 149-158 (1955).


06/17-1