改良Boehenger法酶促检测α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)

文档记录

See QUMAS Change Request number SOP-DEK-ENZ53.
参见QUMAS 变更申请号SOP-DEK-ENZ53。

 

1. 目的

在Sigma-Aldrich(圣路易斯州)建立改良Boehenger法酶促检测α-葡萄糖苷酶的标准流程。

 

2. 适用范围

该流程适用于可检测α-葡萄糖苷酶活性的所有产品。

 

3. 定义

3.1 纯水 – 经去离子系统处理的水,在25ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

3.2. 单位定义 – 在pH 6.0、温度25°C条件下,一个单位每分钟可将1.0微摩麦芽糖转化为2 mole D-葡萄糖。

3.3. ATP –腺苷-5'-三磷酸

3.4. ATP –腺苷-5'-二磷酸

3.5. G-6-P –萄糖-6-磷酸

3.6. NADP+ –β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化形式)

3.7. NADP+ –β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原形式)

3.8. G-6-PDH –葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

 

4. 讨论

麦芽糖 + H2   α – 葡萄糖苷酶   > 2(α - D – 葡萄糖)
2(α - D – 葡萄糖) + 2(ATP)    己糖激酶   > 2(G - 6 - P) + 2(ADP)
2(G - 6 - P) + 2NADP+    G-6-PDH   > 2(6 -磷酸葡萄糖酸) + 2(NADPH) + 2H+

 

5.责任

所有分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

 

6.安全性

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

 

7. 操作步骤

7.1条件:

温度= 25°C,pH = 6.0,A340nm,光程= 1 cm 

 

7.2方法:
光谱法
终止/终点测定

 

7.3试剂:

7.3.1     7.3.1. 100 mM醋酸钠,0.05% (w/v)四水合物无水乙二胺四乙酸四钠,pH 6.0, 25°C(缓冲液)
采用纯水,制备13.61 mg/ml三水合物醋酸钠Sigma-Aldrich货号S8625)溶液和0.55 mg/ml四水合物无水乙二胺四乙酸四钠(Sigma-Aldrich货号ED4SS)溶液。将pH在25°C下调至6.0。

7.3.2     20% (w/v)麦芽糖
采用纯水和I级一水麦芽糖(Sigma-Aldrich货号M5885)制备200 mg/ml溶液。

7.3.3     葡萄糖HK检测试剂(HK)
 使用前,按照标签上标示的体积,现场溶解一瓶葡萄糖(HK)检测试剂(Sigma-Aldrich货号G3293)。

7.3.4    α-葡萄糖苷酶(酶)
临加入反应混合物之前,采用低温纯水现配含3-5 units/mα-葡萄糖苷酶的溶液。

 

7.4 步骤 1 – 酶终止反应

7.4.1    启动沸水浴,加热至沸腾。.

7.4.2    将下列试剂(ml)加入适宜的容器中:

  试样1 试样2 试样3 空白样
试剂7.3.1(缓冲液 1.40 1.40 1.40 1.40
试剂7.3.2 (麦芽糖 0.50 0.50 0.50 0.50

7.4.3.    倒置混匀,等待温度调至25°C,然后加入:

试剂7.3.4 ( 0.05 0.07 0.10 ----

7.4.4.    M涡旋混匀,在25°C水浴中孵育整整5分钟。立即将样品瓶从25°C水浴中去除,放入沸水浴中。5分钟沸水浴后,加入:

试剂7.3.4 ( 0.05 0.03 ------ 0.10

7.4.5.    再沸水浴5分钟,然后离心5分钟。倒入第7.5步(步骤2)所用的上清液。

 

7.5. 步骤 2 – 酶活性测定

7.5.1.    将下列试剂(ml)加入适宜的培养皿中:

试剂7.3.3 (HK) 2.90 2.90 2.90 2.90

7.5.2.    使用适宜的恒温光谱分析仪调整至25°C,记录所有试样和空白样反应混合物的初始A340 nm (AI)。然后加入:

试剂7.4.4 (上清 0.10 0.10 0.10 0.10

7.5.3.    倒置混匀,监测 A340 nm 增量,直至Δ A340nm / min ≤ 0.0020,此速率须至少维持5分钟。记录最终的A340 nm (AF)。校正后的A340nm 应处于0.20至0.55范围内。

 

7.6 计算

7.6.1    ΔA = AF - AI

7.6.2

  单位/mg酶= (ΔA 试样 - ΔA 空白样)(3.00) (2.00) (df)
(6.22)(2)(0.10)(5)(mg 酶)

 

7.6.3.    

    3.00 = 第7.5步(步骤1)中的反应混合物体积(ml)
    2.00 =第7.4步(步骤2)中的反应混合物体积(ml)
    df = 酶稀释系数
    6.22 = NADPH的毫摩消光系数
    2 = 每µmole麦芽糖的NADPHµmole数
    0.10 = 第7.4步(步骤1)反应混合物中所用的酶体积
    0.10 = 第7.5步(步骤2)反应混合物中所用的酶体积
    5 = 孵育时间(min)

 

7.7最终检测体系浓度:
不适用

 

8. 参考文献和附件

 

9.审批

本文档将采用DocCompliance (QUMAS)生成的电子审核、批准和签名。如需带有签名验证的硬拷贝,请打印“供使用”副本。

 

材料