酸性磷酸酶的酶促测定(EC 3.1.3.2)


 文档记录

EDMS中提供了文档的历史记录。


 1. 目标

建立酸性磷酸酶的标准化酶促测定步骤。


 2. 适用范围

此实验步骤适用于所有酸性磷酸酶产品。


 3. 定义

3.1. 纯净水 - 来自去离子系统的水,电阻率>或=18MΩ•cm @25ºC

3.2. 活力单位定义 - 一个单位可在pH 4.8,37ºC下每分钟水解1.0μmole的对硝基苯磷酸盐。


 4. 讨论

对硝基苯磷酸盐+ H2酸性磷酸酶>对硝基苯酚+ Pi


 5 .责任

所有经培训的分析服务人员都有责任遵循该书面实验步骤。


 6. 安全

有关危险和适当的操作注意事项,请参阅安全数据表(SDS)。


 7. 操作步骤

7.1 条件:
T = 37℃,pH = 4.8,A410nm,光路= 1 cm

7.2方法:
分光光度法终止率测定

7.3 试剂:

7.3.1 90 mM柠檬酸盐缓冲液,37°C下pH为4.8(缓冲液
在纯净水中制备26.5mg/ml柠檬酸(三钠,二水合物)溶液(Sigma-Aldrich货号C7254)。用1M NaOH/HCL在37℃下调节pH至4.8。

7.3.2 15.2 mM对硝基苯磷酸盐(PNPP
使用对硝基苯基磷酸盐(Sigma-Aldrich库存号104-0或Sigma-Aldrich货号S6750)在纯化水中制备5.64mg/ml溶液。

7.3.3 100mM氢氧化钠溶液 (NaOH)
使用200ml容量瓶,在200毫升纯净水中稀释20毫升1.0 N氢氧化钠(Sigma-Aldrich货号S2567)。

7.3.4 酸性磷酸酶酶溶液(
使用前,在冷的纯净水中制备含有0.15-0.25单位/毫升的酸性磷酸酶溶液。

7.4试验方法

7.4.1 移取(以毫升计)以下试剂至合适的容器中:
 

  试样 空白样
试剂7.3.1(缓冲液 0.50 0.50
试剂7.3.2(PNPP 0.50 0.50

 

7.4.2 通过倒置混合并平衡至37℃。然后添加:

试剂 7.3.4( 0.10 ----

 

7.4.3立即通过倒置混合,并在37℃下孵育10分钟。然后添加:

试剂 7.3.3(NaOH 4.00 4.00
试剂 7.3.4( ----- 0.10

 

7.4.4 通过倒置混合并使用合适的分光光度计记录测试和空白的A410nm值。

7.5 计算
 

7.5.1 单位/ml酶= ΔA410nm 测试 - ΔA410nm 空白)*(5.1)*(df)
(10)*(18.3)*(0.1)

 

其中:
5.1=溶液的总体积(以毫升计)
df=稀释因子
10=根据活力单位定义的检测时间(以毫升计)
18.3=对硝基苯酚的毫摩尔消光系数
0.1=所使用酶的体积(以毫升计)
 

7.5.2 Unit/mg固体= 单位/ml酶
mg固体/ml酶

 

7.5.3 单位/mg蛋白 = 单位/ml酶
mg蛋白质/ml酶

 


7.6 最终分析浓度

在1.10ml反应混合物中,最终浓度为41mM柠檬酸、6.9mM对硝基苯磷酸盐和0.015-0.025单位酸性磷酸酶。


 8. 参考文献和附件

Bergmeyer, H.U., Gawehn, K., and Grassl, M. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer H.U.) Volume I, 2nd ed., 495-496, Academic Press, Inc., New York, NY

Replacing OP SSPNPP02.


 9. 审批

本文档将采用EDMS生成的电子审核、批准和签名。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“供使用”副本。


 材料