醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的酶学测定

 描述

该方法适用于醇脱氢酶产物,但不溶形式的醇脱氢酶(货号:A2529)除外。

连续分光光度法速率测定(A340,光程 = 1cm)基于以下反应:


β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,氧化
β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,还原

单位定义:一个单位的醇脱氢酶在pH 8.8、25℃下,每分钟将1.0 μmole乙醇转化为乙醛。
 


 需要的试剂和设备

磷酸(货号:438081
焦磷酸钠,四元,十水合物(货号:221368
乙醇95%(v/v)(货号:493538
β-NAD水合物(货号:N6522
磷酸钠,一元,一水合物(货号:S9638
5 M磷酸钠,一元溶液(货号:74092
磷酸钠,二元(货号:S9763
0.5 M磷酸钠,二元溶液(货号:94046
牛血清白蛋白(货号:A9647


 注意事项

有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。
 

 制备说明

使用超纯水(25°C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率)制备试剂。

9.5%(v/v)磷酸 — 在纯水中制备0.095 mL/mL磷酸(货号:438081)溶液。

50 mM磷酸钠缓冲液,pH 8.8(25℃) — 在超纯水中制备22.3 mg/mL焦磷酸钠四元十水合物(货号:221368)溶液。在25℃下用9.5%(v/v)磷酸将pH调节至8.8。

乙醇95%(v/v)(货号:493538

15 mM β-NAD(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)溶液 — 在超纯水中制备11.6 mg/mL的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物(货号:N6522)溶液。

10 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.5(25℃)— 制备500 mL缓冲液:加入21.0 mL 0.2 M磷酸钠二元溶液,该溶液由0.5 M磷酸钠二元溶液(货号:94046)制备而来。然后加入4.0 mL 0.2 M磷酸钠一元溶液,该溶液由5 M磷酸钠一元溶液(货号:74092)制备而来。最后用超纯水定容500 mL。在25 °C下用1 M NaOH或1 M HCl将pH值调节至pH 7.5。

酶稀释液(10 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.5,含0.1%(w/v)牛血清白蛋白)— 在10 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中制备1 mg/mL牛血清白蛋白(货号:A9647)溶液 。用1 M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5(25°C)。

ADH原液 — 在pH 7.5的冷(2-8°C)10 mM磷酸钠缓冲液中制备1 mg/mL醇脱氢酶溶液。
注意:现配现用。

ADH工作溶液 — 在使用前,立即用冷酶稀释液将0.050 mL ADH原液稀释至25.0 mL。
注意:现配现用。

注意:如果该酶浓度产生ΔA340/分钟 > 0.15,则用冷酶稀释液将0.050 mL ADH原液稀释至50.0 mL。如果测定粗产物,则仅相应修改酶稀释方案。


 操作步骤

在3.00 mL反应混合物中,最终浓度为22 mM焦磷酸钠,3.2%(v/v)乙醇,7.5 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,0.3 mM磷酸钠,0.003%(w/v)牛血清白蛋白,和0.001-0.002 mg/ml醇脱氢酶。 1. 在合适的比色皿中,准确移取以下物质:

 

试剂 测试1(mL) 测试2(mL) 测试3(mL) 空白(mL)
50 mM磷酸钠缓冲液,pH 8.8 1.30 1.30 1.30 1.30
95% (v/v)乙醇 0.10 0.10 0.10 0.10
15 mM ß-NAD溶液 1.50 1.50 1.50 1.50

 

2. 倒置混合。将比色皿放入适当恒温的分光光度计中平衡至25℃。

3. 然后添加:

 

试剂 测试1 (mL) 测试2 (mL) 测试3 (mL) 空白 (mL)
ADH工作溶液 0.10 0.10 0.10
酶稀释液     0.10


4. 立即通过倒置混合,并记录A340的增加约6分钟。

5. 对于测试和空白,使用1-6分钟的范围获得A340 /分钟。


 结果

计算

1.

单位/mL酶 =

(ΔA340/min测试 – ΔA340/min空白) (3.0) (df)

(6.22) (0.1)

     3.0 = 测定的总体积(mL)
     df = 稀释因子
     6.22 = 在340 nm处的毫摩尔β-NADH消光系数
     0.1 = 使用的酶溶液的体积(mL)



2.

单位/mg固体 =

单位/mL酶

mg固体/mL酶


 材料

     

  

 参考文献

  1. Kagi, J.H.R., and Vallee, B.L., Journal of Biological Chemistry235, 3188-3192 (1960).