碱性磷酸酶的酶法测定,二乙醇胺法 (EC 3. 1. 3. 1)


 1. 目的

为了标准化碱性磷酸酶、二乙醇胺的酶促测定程序。


 2. 范围

2.1  本程序适用于所有对使用二乙醇胺测定系统的碱性磷酸酶有规格要求的产品。

2.2  本酶法不应用于测定仅在甘氨酸单位引用比活性的碱性磷酸酶。


 3. 定义

3.1  纯化水——来自去离子系统的水,电阻率 ~18MΩcm@25°C

3.2 单位定义——一个 DEA 单位可在 37°C pH 9.8 时每分钟水解 1.0 μmole 的磷酸对硝基苯酯。

3.3  Pi——无机磷酸盐


 4. 讨论

磷酸对硝基苯酯 +H2O    碱性磷酸酶   > 对硝基苯酚 + Pi


 5. 责任

所有经过培训的分析服务人员都有责任按照书面说明遵守本方案。


 6. 安全

有关危险和适当的处理预防措施,请参阅安全数据表 (SDS)。


 7. 方案

7.1 条件:


T=37℃,pH=9.8,A750 nm,光路 =1 cm

 

7.2 方法:


连续分光光度法测定

 

7.3 试剂:

7.3.1 1.0 M 二乙醇胺缓冲液,含 0.50 mM 氯化镁,pH 9.8,37°C(缓冲液)
用二乙醇胺在纯化水中配制 140 mg/mL 的溶液,如产品编号 D8885。用 5m HCl 在 37℃ 调节二乙醇胺的 pH 值至 9.8。用纯化水将 pH 调节溶液稀释至 105 mg/mL 二乙醇胺终浓度,并加入 0.5 mL/L 1M 氯化镁溶液,如产品编号 M1028

新鲜制备,避光。

7.3.2 0.67 M 磷酸对硝基苯酯溶液 (PNPP)
用磷酸酶底物在纯化水中配制 247 mg/mL 溶液,如产品编号 P4744新鲜制备,避光。

7.3.3  碱性磷酸酶酶液(酶)

7.3.3.1  临用前,在冷缓冲液中配制含有约 0.15 单位/mL 碱性磷酸酶的溶液。

7.3.3.2  对于液体样品,使用前立即在冷缓冲液中配制浓缩(2000 单位/mL 或更高)的储备溶液。进行后续稀释,使最终溶液在冷缓冲液中含有约 0.15 单位/mL。

 

7.4 试验方法:

7.4.1 将下列试剂按以下顺序(按毫升数)移液到相应的比色杯中:

 

  试验  1 试验 2 试验 3 空白
缓冲液(试剂 7.3.1) 2.91 2.905 2.90 2.95
PNPP(试剂 7.3.2) 0.05 0.05 0.05 0.05

 

7.4.2  倒置混合,平衡至 37℃。使用恒温分光光度计监测 A405 nm 直至恒定。然后添加:

 

  试验 1 试验 2 试验 3 空白
酶(试剂 7.3.3) 0.04 0.045 0.05 -----

 

7.4.3  立即倒置混匀,记录 A405 nm 处的增加约 5 min。在一分钟的时间间隔内使用最少四个数据点,使用测试物和空白的最大线性速率获得 ΔA405 nm/分钟。

 

7.5  计算

7.5.1 单位/ml 酶 = (ΔA 405 nm min测试物 - ΔA 405 nm min 空白 (V F)
(18.5)(VE)

 

7.5.2 单位/毫克固体 = 单位/ml 酶
mg 固体/ml 酶

 

7.5.3 单位/mg 蛋白质 = 单位/ml 酶
mg 蛋白/ml 酶

 

7.5.4 VF= 测定体积(毫升)
df= 稀释因子
18.5= 对硝基苯酚在 405 nm 处的毫摩尔消光系数
VE= 所用酶的体积(毫升)

 

7.6  最终测定浓度
在 3.00 mL 反应混合物中,终浓度为 983 mm 二乙醇胺,0.49 mm 氯化镁,11.2 mm 对硝基苯磷酸酯和约 0.0075 U 碱性磷酸酶。


 8. 参考文献

8.1    Walter, K. and Schütt, C. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U. ed) 2nd ed., Volume II, pp 860-864, Academic Press, Inc., NY

8.2    E. Moessner, M. Boll, G. Pfleiderer, Hoppe-Sayeler’s Z. Physiol. Chem. Vol. 361, page 543-549, April 1980.


 9. 审批

本文件的审查、核准和签字将使用 EDMS 以电子方式生成。如果需要带签名验证的纸质副本,打印一份带“待用”字样的副本。


 材料