淀粉葡萄糖苷酶的酶学测定(EC 3.2.1.3)


 描述

本操作程序可用于使用淀粉作为底物测定淀粉葡萄糖苷酶的活性。分光光度法停止速率测定 [340 nm处的吸光度(A340),光程= 1cm] 基于以下反应:

淀粉葡萄糖苷酶

淀粉+水 ––––––––––––––––> D-葡萄糖

己糖激酶
D-葡萄糖 + ATP ––––––––––> 葡萄糖-6-磷酸盐 + ADP

G-6-PDH
葡萄糖-6-磷酸盐 + β-NADP ––––––––––> 6-PG + β-NADPH


ADP -  二磷酸腺苷
ATP -  三磷酸腺苷
G-6-PDH ​​- 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
β-NADP - β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐,氧化形式
β-NADPH - β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐,还原形式
6-PG - 6-磷酸-D-葡糖酸盐

单位定义 — 一个单位的淀粉葡萄糖苷酶在pH 4.5、55℃下,在3分钟内从淀粉中释放1.0 mg葡萄糖。


 注意事项

有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。


 需要的试剂和设备

乙酸钠,三水合物 (货号:S8625)
马铃薯淀粉 (货号:S2004)
6.1 N三氯乙酸溶液 [~100% (w/v), 货号:T0699]
葡萄糖测定试剂 (货号:G3293)
碳酸氢钠 (货号:S8875)


 制备说明

使用超纯水(25°C时 ≥ 18 MΩ×cm)制备试剂。

缓冲液(50 mM乙酸钠,pH 4.5,55℃)— 使用乙酸钠,三水合物(货号:S8625)在超纯水中制备6.8 mg/ml溶液。55ºC下,用1 M HCL调节至pH 4.5。

淀粉溶液 [1%(w/v)] — 用可溶性马铃薯淀粉(货号:S2004)在缓冲液中制备10 mg/ml溶液。在60-80℃下加热约15分钟以促进溶解。请勿煮沸。在整个测定过程中使溶液缓慢混合。

酶溶液(淀粉葡萄糖苷酶)— 在即将使用前,在冷的超纯水中制备溶液(0.40 - 0.80 mg固体/ml)。然后立即在55℃纯水中稀释至0.3 - 0.6单位/ml 淀粉葡萄糖苷酶。最终反应混合物必须含有0.15 - 0.60单位的淀粉葡萄糖苷酶。

TCA溶液 [(50%(w/v)三氯乙酸溶液] — 在超纯水中制备2倍稀释的6.1 N三氯乙酸溶液 [~100%(w/v),货号:T0699]。

葡萄糖测定试剂(HK)— 在即将使用前,用超纯水溶解一小管葡萄糖测定试剂(货号:G3293)的内容物,使用标签上包装大小所示的体积。


 操作程序

在2.00 ml反应混合物中,最终浓度为25 mM乙酸钠、0.5%(w/v)淀粉、和0.15–0.60单位淀粉葡萄苷酶。

酶促停止反应

1. 将以下试剂移液到合适的容器中
 

试剂 测试1 (ml) 测试2 (ml) 测试3 (ml) 空白 (ml)
淀粉溶液 1.00 1.00 1.00 1.00

 

2. 平衡至55 ℃。然后添加:

试剂 测试1 (ml) 测试2 (ml) 测试3 (ml) 空白 (ml)
酶溶液 0.50 0.70 1.00


3. 立即涡旋混合,55°C温育刚好3分钟。然后添加:

试剂 测试1 (ml) 测试2 (ml) 测试3 (ml) 空白 (ml)
TCA溶液 0.30 0.30 0.30 0.30
酶溶液 0.50 0.30 1.00


4. 涡旋混合,并用固体碳酸氢钠(货号:S8875)调节至pH 7.0。

5. 通过0.1 μm PVDF 针头式过滤器(货号:F7523)过滤,并在酶活性测定步骤4中使用滤液。

酶活性测定

1. 移取以下试剂到合适的比色皿中:
 

试剂 测试1 (ml) 测试2 (ml) 测试3 (ml) 空白 (ml)
葡萄糖测定试剂 2.80 2.80 2.80 2.80

2. 平衡至25 ℃。使用适当恒温的分光光度计监测A340直至恒定。

3. 记录测试和空白试样的初始A340

4. 然后添加:
 

试剂 测试1 (ml) 测试2 (ml) 测试3 (ml) 空白 (ml)
适当的测试滤液,酶促停止反应,步骤5 0.20 0.20 0.20
空白滤液,酶促终止反应,步骤5 0.20


5. 立即倒置混合。监测A340,直到DA340/min < 0.0020,并且此速率保持至少5分钟。

6. 记录测试和空白试样的最终A340


 结果

计算

1. ΔA340 = A340 最终 – A340 初始

2.

单位/ml酶 = (ΔA340 测试 – ΔA340 空白) (180) (2.3) (3.0) (df)
------------------------------------------------------------------
(6.22) (1,000) (ml 酶) (0.20)

试中:

180 = 每微摩尔葡萄糖的葡萄糖微克数
2.3 = 酶促终止反应的总体积(以毫升计),步骤1-5
3.0 = 酶活性测定的总体积(以毫升计),步骤1-6
df = 稀释因子
6.22 = β-NADPH在340 nm处的毫摩尔消光系数
1,000 = 从微克到毫克的转换系数
ml酶 = 在酶促终止反应中添加的酶溶液的体积,步骤2
0.20 = 用于酶活性测定的酶促终止反应的体积(以毫升计)

3.

单位/mg固体 = 单位/mL酶
----------------
mg固体/ml酶


 材料

     


 参考文献

Bergmeyer, H.U. et al., Methods of Enzymatic Analysis  (Bergmeyer, H.U., ed.) Second Edition, Volume I, 434-435 (1974).