酶促检测抑肽酶

1. 目的

建立酶促检测抑肽酶的标准化操作步骤。

 

2. 适用范围

该流程适用于可检测抑肽酶活性的所有产品。

 

3. 定义

3.1 在pH 7.8、25ºC条件下一个胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)可将2单位胰蛋白酶活性降低50%,其中一单位的胰蛋白酶每分钟可以水解1.0 μmole的N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)。

3.2纯水 – 经去离子系统处理的水,在25ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

 

4. 讨论

抑肽酶可以抑制以下反应:

N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺    胰蛋白酶   > Nα-苯甲酰-DL-精氨酰+对硝基苯胺

 

5. 责任

经过培训的分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

 

6. 安全性

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

 

7. 条件:

温度= 25°C,pH = 7.8,A405nm,光程= 1 cm 

 

7.2 方法:
连续光谱法速率测定

 

7.3 试剂:

7.3.1   200 mM三羟乙基胺缓冲液,20 mM氯化钙,pH 7.8,25°C(缓冲液)
采用纯水、三乙醇胺盐酸盐Sigma-Aldrich货号T1502)溶液和无水氯化钙(如,Sigma-Aldrich货号C3881)制备37.1 mg/ml溶液。采用1 M NaOH将pH在25°C下调至7.8。

7.3.2   N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺溶液(BAPNA)

采用纯水和N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺(Sigma-Aldrich货号B4875)制备1.0 mg/ml溶液。

7.3.2.1   使用前和使用期间,将溶液25°C储存,确保运行期间核心反应混合物处于25°C。

7.3.2.2   如果溶液混浊,温和加热继续搅拌(但不要超过65ºC),直至溶液变澄清。请勿使用变黄的溶液,因为这表示底物因过热而出现化学分解。

7.3.3   1 mM 盐酸溶液(HCl)
采用纯水和盐酸(如,Sigma-Aldrich货号H3162)制备100 ml盐酸溶液。

 

7.3.4   胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶
临使用前,采用低温的试剂7.3.4 (HCl)制备一份含1040-1560 units/mL胰蛋白酶(III型,Sigma-Aldrich货号T4665或同等制剂)的溶液。

7.3.4.1   未抑制情况下的速率必须为 ∆A405nm/min介于0.08-0.12之间。采用低温的试剂7.3.4 (HCl)制备调整试剂试剂7.3.4(胰蛋白酶)的浓度,直至结果处于此范围内。

 

7.3.5   0.85% (w/v) 氯化钠溶液(NaCl)

使用纯Sigma-Aldrich货号S0817或同等制剂。

 

7.3.6   抑肽酶抑制剂溶液(抑制剂
临使用前,采用低温的试剂(NaCl)制备含0.065-0.080 TIU/ml的溶液。

7.3.6.1   为保证检测有效,抑制百分比(%)必须介于40和60%之间。使用低温试剂7.3.5 (NaCl)调整试剂7.3.6(抑制剂)浓度,直至结果处于此范围内。

 

7.4 检测方法

7.4.1   7.4.2    将下列试剂(ml)加入适宜的培养皿中:

 

 

未抑制

抑制

 

空白样

试样

试样

试剂7.3.1(缓冲液

1.600

1.600

1.600

试剂7.3.3 (HCl)

0.200

----

----

试剂7.3.4 (胰蛋白酶

----

0.200

0.200

试剂7.3.5 (NaCl)

0.200

0.200

----

试剂7.3.6 (抑制剂)

----

----

0.200

 

7.4.3   倒置混匀,等待温度调至25°C。使用适宜的恒温分光光谱仪监测A405nm直至最后恒定。然后加入:

试剂7.3.2 (BAPNA)

1.000

1.000

1.000

 

7.4.3   立即倒置混匀,记录大约5分钟内的A405nm增量。根据未抑制试样的最大线性速率获取∆ A405nm/min值,然后采用相同方法计算抑制试样和空白溶液的A405nm/min。

TIU/ml =

(ΔA405nm/min(未抑制) - ΔA405nm/min(抑制)(df)

(9.96)(mL 抑肽酶/mL RM)



其中:
TIU = 胰蛋白酶抑制剂单位
df = 稀释系数
9.96 = 对硝基胺苯在405nm处的摩尔消光系数
RM = 反应混合物

TIU/mg 固体 =

TIU/ml

mg固体/ml

 

抑制率(%)=

(ΔA405nm/min(未抑制) - ΔA405nm/min(抑制) X 100

(ΔA405nm/min(未抑制) - ΔA405nm/min(空白样))

 

7.6 最终检测体系浓度:

在3.00 mL反应混合物中,终浓度为107 mM三乙醇胺、11 mM氯化钙、0.03% (w/v) N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺、0.07 mM盐酸、208-312单位胰蛋白酶、0.057% (w/v)氯化钠和0.013 – 0.015胰蛋白酶抑制剂单位抑肽酶。

 

7.7 备注

7.3.1   除非另行说明,所有货号均为Sigma货号。

 

8. 参考文献和附件

8.1 Fritz, H., Hartwich, G., Werle, E., Hoppe-Seylers Zeitschrift Für Physiologishche Chemie (Berlin) 345, 150-167 (1966).

8.2 Kassell, B., Methods in Enzymology XIX, 844-852 (1970).

8.3 Replaces PROC-DEK-OP-002996 (v1)

 

9. 审批

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材料