β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)的酶促检测

文档记录

改编自SSSTAR02版本。参考CR SOP DEK ENZ 62。

 

1. 目的

建立β-淀粉酶活性测定的标准流程。

 

2. 适用范围

该流程适用于可检测β-淀粉酶活性的所有产品。

 

3. 定义

3.1纯水 – 经去离子系统处理的水,在25ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

3.2.单位定义 – 在pH 4.8、温度20°C条件下,一个单位可在3分钟内从淀粉中释放出1.0 mg麦芽糖。

3.3. STD = 麦芽糖标准品

 

4. 讨论

淀粉 + H2   β-淀粉酶   > 还原基团(麦芽糖)

 

5. 责任

经过培训的分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

 

6. 安全性

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

 

7. 操作步骤

7.1 条件:

温度 = 20°C,pH = 4.8,A540nm,光程 = 1 cm

7.2 方法:

  • 光谱法
  • 终止反应

 

7.3 试剂

7.3.1 16mM乙酸钠缓冲液,在20°C条件下的pH值为4.8

以纯水为溶剂,使用醋酸钠三水合物(Sigma-Aldrich 货号 S8625)制备100 ml缓冲液。在20°C下,使用1 M HCl调整pH至4.8。

7.3.2. 1.0% (w/v)可溶性淀粉溶液(淀粉)

以试剂A为溶剂,使用马铃薯可溶性淀粉(Sigma-Aldrich 货号 S2630)制备25 ml溶液。通过直接在加热/搅拌板上连续搅拌来加热玻璃烧杯中的淀粉溶液,以促进溶解。煮沸并使溶液在该温度下维持15分钟。通过搅拌使淀粉溶液冷却至室温。通过加入纯水使淀粉溶液恢复至原始体积(25ml),然后一边搅拌一边分装,以供测定使用。

7.3.3.  酒石酸钾钠溶液

将12.0g酒石酸钾钠四水合物(Sigma-Aldrich 货号 S2377)溶于预热至50°C - 70°C的8.0 ml 2 M NaOH中。通过直接在加热/搅拌板上连续搅拌加热,使其溶解。请勿煮沸。

7.3.4. 96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液

以预热至50°C - 70°C的纯水为溶剂,使用3,5-二硝基水杨酸(Sigma-Aldrich 货号 D0550)制备20 ml溶液。通过直接在加热/搅拌板上连续搅拌加热,使其溶解。请勿煮沸。

7.3.5. 显色试剂溶液(Clr Rgt Soln)

向温度为50°C - 70°C的12 ml纯水中缓慢加入试剂7.3.3,然后加入试剂7.3.4。终体积为40 ml。如果未完全溶解,则应在混合时溶解。溶液应装在琥珀色瓶中并存放在室温下。显色试剂溶液可稳定保存6个月。

7.3.6. 0.2% (w/v) (STD)

以纯水为溶剂,使用麦芽糖一水合物( Sigma-Aldrich 货号 M5885)制备10 ml溶液。

7.3.7  β-淀粉酶溶液(酶)

7.3.7.1  现配现用,使用20°C的纯水制备含1单位/ml β-淀粉酶的溶液。

7.3.7.2  如果检测酶需要需要稀释,则第一次及随后的稀释均应该使用20°C纯水,直至最后一次稀释,并且最后一次应稀释在20°C纯水中。

 

7.4 测定

7.4.1 将下列试剂移液(毫升级)至合适的容器中:

 

  Test-1 Test-2 Test-3 Blank
Reagent 7.3.2 (Starch) 1.00 1.00 1.00 1.00

 

7.4.2 涡旋混合并平衡至20°C。然后加入:

 

Reagent 7.3.7 (Enzyme) 0.50 0.70 1.00 ----

 

7.4.3 涡旋混合并在20°C孵育3.0分钟。然后加入:

 

Reagent 7.3.5 (Clr Rgt Soln) 1.00 1.00 1.00 1.00

 

7.4.4 盖上透气盖并放在沸水浴中。然后加入:

 

Reagent 7.3.7 (Enzyme) 0.50 0.30 ----- 1.00

 

7.4.5 煮沸15分钟,然后在冰上冷却至室温,冷却时间约为3分钟,然后加入:

 

7.4.6   

Purified water 9.00 9.00 9.00 9.00

 

7.4.7 颠倒混匀,使用合适的分光光度计检测和记录测试样品和空白样品的A540nm

7.4.8 由于3分钟的酶催化孵育时间较短,因此每个测试批次必须一次运行一个。

 

7.5. 标准曲线:

7.5.1 将下列试剂移液(毫升级)至合适的容器中,绘制标准曲线:

 

  Std1 Std2 Std3 Std4 Std5 Std6 Std7 Std 空白
试剂 7.3.6 (STD) 0.05 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 2.00 -----
纯水 1.95 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 ----- 2.00
试剂 7.3.5 (Clr Rgt Soln) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

 

7.5.2 将样品置于沸水浴中煮沸15分钟,然后在冰上冷却至室温,并加入:

 

Purified water 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00

 

7.5.3 颠倒混匀,使用合适的分光光度计检测和记录标准品和空白标准品的A540nm

 

7.6 计算

7.6.1 标准曲线

ΔA540nm 标准品= A540nm Std - A540nm Std空白

绘制ΔA540nm标准品与麦芽糖重量(毫克)的关系图。计算并记录斜率、y截距和线性回归(r2)。

7.6.2 样品测定

ΔA540nm 样品 = A540nm 测试样品- A540nm 空白样品

使用标准曲线确定麦芽糖释放量(毫克)。

7.6.3

单位/Ml 酶 = 麦芽糖释放量mg* (df)
(1)

df=稀释系数

1 = 酶使用体积(单位为ml)

 

7.6.4

单位/mg 固体 = 单位/mL 酶
mg 固体/mL 酶


7.6.5

单位/mg蛋白质 = 单位/mL 酶
mg 蛋白质/mL酶

 

7.7 最终检测度

在2.00ml反应混合物中,终浓度为8 mM乙酸钠、0.50% (w/v)淀粉和1单位β-淀粉酶。

 

8. 参考文献和附件

Bernfeld, P. (1955) Methods in Enzymology 1, 149-158

 

9. 审批

本文档将采用DocCompliance (QUMAS)生成的电子审核、批准和签名。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“供使用”副本。

 

材料