酶促检测罗马蜗牛和牛肝脏来源ß-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)

1. 目的

建立酶促检测罗马蜗牛和牛肝脏来源ß-葡萄糖醛酸酶1的标准化操作步骤。1.

 

2. 适用范围

适用于可检测罗马蜗牛和牛肝脏来源ß-葡萄糖醛酸酶的所有产品。

 

3. 定义

在pH 5.0、温度37°C条件下,一单位sigma或改良的“Fishman”每小时可从苯酚葡萄糖醛酸中释放出1.0 mg酚酞。

 

4. 讨论

PheP-Gluc + H2O   b-葡萄糖醛酸酶   >D-葡萄糖醛酸脂 + 酚酞

缩写:

PheP-Gluc = 葡萄糖醛酸苯酚

 

5. 责任

所有分析服务实验室人员均有责任遵守本文所述流程。

 

6. 安全性

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

 

7. 操作步骤

7.1条件:

T = 30°C,pH = 5.0,A540nm,光程 = 1 cm

7.2方法:

光谱法
终止/终点测定

7.3试剂:

7.3.1   100 mM醋酸钠缓冲液,pH 5.0,37°C
(采用去离子水和三水合物醋酸钠Sigma-Aldrich货号S8625)配制50 ml溶液。采用1 M HCl将pH在37°C下调至5.0。)

7.3.2    1.2 mM 葡萄糖醛酸苯酚底物溶液(PheP-Gluc)
(采用8 ml去离子水稀释1ml葡萄糖醛酸苯酚(Sigma货号105-4)配制)

7.3.3    200 mM 甘氨酸缓冲溶液,pH 10.4

(采用去离子水和无甘氨酸碱(Sigma货号G7126)配制100 ml。采用1 M NaOH将pH在37°C下调至5.0。)

7.3.4    0.2% (w/v) 氯化钠溶液 (NaCl)

(采用去离子水和氯化钠(Sigma-Aldrich货号S9888)配制20 ml。)

7.3.5    b-葡萄糖醛酸酶溶液

(须现用现配,采用低温试剂7.3.4配制含250-500 units/ml b-葡萄糖醛酸酶的溶液)


7.3.6    95% (v/v) 乙醇

(采用去离子水和200 Proof USP乙醇(Sigma货号Z5130)配制20 ml。)

7.3.7    0.05% (w/v) 酚酞标准溶液(标准样溶液)

(采用试剂7.3.6和1.0 mg酚酞(Sigma-Aldrich货号P9750)配制2 ml)

 

7.4 反应体系:


7.4.1   将下列试剂(ml)加入适宜的培养皿中:

  试样 空白样
试剂A(缓冲液) 0.70 0.70
试剂B(PheP-Gluc) 0.70 0.70

 

7.4.2    倒置混匀,恢复至37°C,然后添加:

 

  试样 空白样
试剂E(酶溶液) 0.10 -----

 

7.4.3    倒置混匀并在37°C下孵育整整30分钟,然后添加:

 

  试样 空白样
试剂C(甘氨酸缓冲液) 5.00 5.00
试剂E(酶溶液) ----- 0.10

 

7.4.4   立即倒置混匀。将溶液转移到适宜的容器中,使用适宜的分光光度计记录试样和空白样的A540nm

7.4.5    标准曲线:

将以下试剂加入适宜的容器中,根据加样量(ml)绘制标准曲线:

 

  标准样1 标准样2 标准样3 标准样4 空白样
试剂A(缓冲液) 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70
试剂B (PheP-Gluc) 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70
试剂G(标准样溶液) 0.03 0.05 0.07 0.10 -----
试剂F(乙醇) 0.07 0.05 0.03 ----- 0.10
试剂C(甘氨酸缓冲液) 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00

 

7.4.6    倒置混匀并将标准样转移到适宜的容器中。使用适宜的分光光度计记录各标准样的A540nm

 

8. 计算

8.1    标准曲线:

标准样ΔA540  = 标准样A540  - 标准空白样 A540 

通过比较标准样和酚酞的mg 数,绘制ΔA540 标准曲线。

8.2    样品测定:

样品ΔA540  = 样品A540  - 空白样A540 
通过标准曲线确定释放的总酚酞量(mg)。

 

单位/ml 酶 =

(释放的酚酞mg数)(2)(df)

0.1

 

2 = 依照单位定义,从30分钟至1小时的换算系数
df = 稀释因子
0.1 = 所用的酶体积(ml)

 

单位/mg 固体 =

 单位/mL酶

mg固体/mL酶

 

单位/mg 蛋白 =

单位/mL酶

mg蛋白/mL酶

9. 最终检测体系浓度:

在1.50 ml 反应混合物中,终浓度为47 mM 醋酸钠,0.56 mM 葡萄糖醛酸酚酞,25-50单位b-葡萄糖醛酸酶。

 

10. 参考文献和附件

10.1    Fishman, W.H. and Bernfeld, P. (1955) Methods in Enzymology, Volume I, 262-269

10.2    Combie, J., Blake, J.W., Nugent, T.E., and Tobin, T. (1982) Clin. Chem 28, 83-86

10.3    Fishman, W.H. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U. ed) 2nd ed., Volume II, 929-932, Academic Press, New York, NY

 

11. 备注

11.1    此检测方法不可用于检测结合在琼脂糖珠上的不可溶b-葡萄糖醛酸酶(Sigma 货号G4506)。

11.2    此检测方法基于引用文献内容。.

11.3    历史记录证明产物非常稳定。

11.4    可使用P9750 作为酚酞标准液或标准溶液105-1(以便利为准)。

11.5    Sigma担保上述操作步骤信息为Sigma在用,且Sigma产品与Sigma出版物上的信息吻合。购买者必须自行判定相关信息的适用性和产品对于特定用途的适用性。购买Sigma产品时,请参阅发票背面或装箱单上的附加销售条款及条件。

 

12. 审批

  机打姓名
签名 头衔 日期
编制: Carrie Cupp Carrie Cupp 化学家 7/20/04
2004/07/20
审批: David Lintz David Lintz 分析服务主管 8/13/04
2004/08/13
审批: Gene McNaughton Gene McNaughton 质检员 8/16/04
2004/08/16

 

材料