酶促检测羧肽酶A

1. 目标

在Sigma-Aldrich(圣路易斯州)建立酶促检测羧肽酶A的标准流程。

 

2. 适用范围

此操作步骤适用于所有包含羧肽酶A的产品,包括但不限于牛胰腺来源羧肽酶A(Sigma-Aldrich货号C9268)。

 

3. 定义

3.1 纯水 – 经去离子系统处理的水,在25ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

3.2. 羧肽酶A单位定义 – 在pH 7.5、温度25°C条件下,一个单位每分钟可水解1.0 μmole马尿酸-L-苯丙氨酸。

 

4. 讨论

马尿酸-L-苯丙氨酸    羧肽酶A    >马尿酸+苯丙氨酸

 

5.责任

经过培训的分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

 

6.安全性

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

 

7.操作步骤

7.1 条件:

T = 25°C,pH = 7.5,A254nm,光程= 1 cm

7.2 方法:

持续光谱分析速率测定

7.3 试剂:

7.3.1    25 mM Tris HCl 缓冲液,含500 mM 氯化钠,pH 7.5,25°C(缓冲液)
           采用纯水,制备含3.03mg/ml Trizma碱(如Sigma-Aldrich货号T1503)、29.2mg/ml氯化钠(如Sigma-Aldrich货号S9888)的溶液。采用1N盐酸在25°C下降pH调整至7.50。在室温下保存溶液。

7.3.2    1.0 mM马尿酸-L-苯丙氨酸溶液(Hippuryl-L-Phe)
            采用200 Proof乙醇制备含32.6 mg/ml 马尿酸-L-苯丙氨酸(如Sigma-Aldrich货号H6875)的溶液。样品一旦完全溶解到乙醇中时,采用试剂7.3.1(缓冲液)进一步稀释到0.326 mg/ml。请勿调节此溶液的pH。在室温下储存溶液,并在制备后三小时内使用。

7.3.3    1.0 M 氯化钠溶液(酶稀释液)
            采用纯水制备含58.4 mg/ml氯化钠(如Sigma-Aldrich货号S9888)的溶液。在室温下保存溶液。

7.3.4     羧肽酶A溶液(酶)

7.3.4.1   使用前,在室温下现配含有4-8 units/ml 羧肽酶A的试剂7.3.3(酶稀释液)。

7.3.4.2    请勿采用低温试剂7.3.3稀释酶。

7.3.4.3    每一等份样品均需采用试剂7.3.3(酶稀释液)配制新鲜稀释液。

7.3.4.4    针对每份样品单独稀释,并再次确认来自同一容器或批次的等份样品一致。

7.3.4.5    倾倒样品前,务必振荡样品,确认所有沉到管底的材料均为均质溶液。

7.4 操作步骤

7.4.1    一次运行一等份,因为最大速率通常出现在第一分钟。

7.4.2    针对试剂7.3.2提供光谱分析空白样。由于试剂 7.3.2具有高吸光度,检测需要在精确度高于吸光度2.0的情况下运行。

7.4.3    将以下成分加入到适宜的石英培养皿中:

 

  试样 空白样
Hippuryl-L-Phe(试剂7.3.2) 2.90 2.90

 

7.4.4    使用适宜的恒温光谱分析仪调整至25°C,然后加入以下成分(ml):

 

酶稀释液(试剂7.3.3)          ---- 0.10
酶(试剂7.3.4) 0.10 ----

 

7.4.5    倒置混匀,然后记录大约5分钟内的在254nm出的吸光度。获取一分钟时间间隔内试样和空白反应物的最快线性速率(ΔA254nm/min)。为保证数据有效,每次反应的ΔA254nm/min必须处于0.05 至 0.1之间。

7.5 计算

7.5.1

 

  

单位/ml 酶 = (ΔA254nm/min 试样 - ΔA254nm/min 空白样)(3.00)(df)
(0.36)(0.10)

 

7.5.2 

 

  单位/mg 固体 = Unit/ml 酶
mg 固体/ml 酶

 

7.5.3

 

  

单位/mg 蛋白质= 单位/ml酶
单位蛋白质/ml酶


    3.00 =检测体系总体积(ml)
    df = 酶稀释系数
    0.36 = 马尿酸在254 nm处的毫摩消光系数
    0.10 = 所用的酶体积(ml)

7.6 最终检测体系浓度:

在3.00 ml反应混合物中,终浓度为24 mM Tris,0.96% 乙醇,0.97 mM马尿酸-L-苯丙氨酸,512 mM 氯化钠和0.4-0.8单位羧肽酶 A。

8. 参考文献和附件

8.1 Bergmeyer, H.U., Gawehn, K., and Grassl, M. (1974) Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) Volume 1, 2nd ed., 436-437, Academic Press, Inc. New York, NY

8.2 Replaces Enzyme OP SPHPHE01 Version 1

 

9. 审批

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材料