过氧化氢酶的酶学测定(EC 1.11.1.6)

 描述

该程序可用于所有过氧化氢酶产品。

连续分光光度法速率降低测定(A240,光程 = 1cm)基于以下反应:

单位定义:一个单位的过氧化氢酶在pH 7.0、25 ℃下每分钟分解1.0 μmole的H2O2,而H2O2浓度从10.3 mM降至9.2 mM。通过观察240 nm处吸光度的降低速率来观察H2O2的消失速率。

 

 需要的试剂和设备

1.0 M磷酸氢二钾溶液(货号:P8584

1.0 M磷酸氢钾溶液(货号:P8709

氢氧化钾(货号:P1767

盐酸(货号:H1758

过氧化氢 [30% (w/w),货号:H1009]

比色皿和恒温分光光度计

注意事项

有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。 

 

 准备说明(存储 / 稳定性)

使用超纯水(25°C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率)制备试剂。

1.     磷酸盐缓冲液(50 mM磷酸钾缓冲液,pH 7.0,25°C) 
制备200毫升: 
• 将6.15 ml的1.0 M磷酸氢二钾溶液(货号:P8584)加入烧杯中。 
• 加入3.85 ml的1.0 M磷酸氢钾溶液(货号:P8709)。 
• 使用超纯水将最终体积补足至200 ml。 
• 使用1M KOH或HCl在25°C下将pH调节至7.0。

2.     过氧化氢溶液 [0.036%(w/w)] — 使用过氧化氢 [30%(w/w),货号:H1009] 在磷酸盐缓冲液中制备。使用磷酸盐缓冲液作为空白剂确定该溶液的A240。A240必须在0.550与0.520吸光度单位之间。如有必要,加入过氧化氢以增加吸光度,或加入磷酸盐缓冲液以降低吸光度。在测定过程中保持溶液在冰上冷却。 

3.     过氧化氢酶溶液 —  
• 过氧化氢酶产品以冻干粉形式提供。 
  a. 在冷磷酸盐缓冲液中制备10 mg/ml的初始溶液(该溶液略微混浊)。 
  b. 使用前,立即用冷磷酸盐缓冲液稀释至~100 单位/ ml。二次稀释液必须每次现配现用。 
• 过氧化氢酶产品以结晶悬浮液形式提供,例如货号C30。 
   a. 将产品在37℃孵育约1小时以完全溶解。 
   b. 使用正排量移液管,在37°C磷酸盐缓冲液中制备~1,000单位/ml的初始稀释液。 
   c. 在37°C孵育初始稀释液约1小时,直至溶解(无漩涡)。 
   d. 使用前,立即在37°C磷酸盐缓冲液中二次稀释至~100单位/ml。 
二次稀释液必须每次现配现用。

 步骤

最终测定浓度 — 在3.00 ml反应混合物中,最终浓度为:~50 mM磷酸钾,0.036%(w/w)过氧化氢和~10单位过氧化氢酶。

  1. 使用设置在A240和25°C的合适的恒温分光光度计,与含有磷酸盐缓冲液的石英比色皿比较将仪器调零。
  2. 将2.90 ml过氧化氢溶液吸移到石英比色皿中。 
    说明:一次只运行一个测试。
  3. 将比色皿放入分光光度计中,使底物平衡至25℃。
  4. 然后向比色皿中加入0.10 ml过氧化氢酶溶液。通过倒置立即混合,每秒读取一次读数、共读取约180秒,以监测吸光度的降低。
  5. 记录A240从0.45降低到0.40吸光度单位所需的时间。 
  6. 一式三份执行步骤1-5。

 结果

计算 
1.

单位/ml酶 = 

(3.45) (df)

(时间) (0.1)  

式中:

3.45 = 对应于3.0 ml反应混合物中3.45 μmol过氧化氢的分解,使A240从0.45降至0.40 
df = 稀释因子 
时间 = A240从0.45降低到0.40吸光度单位所需的分钟数 
0.1 = 加入比色皿中酶的毫升数

2.

 材料

     

 参考文献

1.     Beers, R.F. Jr., and Sizer, I.W., Journal of Biological Chemistry, 195, 133-140 (1952).

2.     Stern, K.G., Journal of Biological Chemistry, 121, 561-572 (1937).

09/17-1