纤维素酶的酶学测定


 1. 目标

为了标准化纤维素酶酶学测定的程序步骤。


 2. 范围

该程序适用于所有纤维素酶和半纤维素酶产品。


 3. 定义

3.1 方法:分光光度停止速率测定

3.2 条件:T = 37°C,pH = 5.0,Abs340nm,光程 = 1 cm

3.3 ATP = 腺苷5'-三磷酸

3.4 ADP = 腺苷5'-二磷酸

3.5 β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,氧化形式

3.6 β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,还原形式

3.7 G-6PDH = 葡萄糖6-磷酸脱氢酶

3.8 G-PG = 6-磷酸-D-葡糖酸盐

3.9 纤维素 + H2O纤维素酶 > D-葡萄糖

3.10 D-葡萄糖 + ATP己糖激酶 > D-葡萄糖6-磷酸盐 + ADP

3.11 D-葡萄糖6-磷酸盐 + β-NAD G-6PDH > 6-PG + β-NADH

3.12 单位定义:在pH 5.0、37℃下(孵育时间为2小时),一个单位在1小时内从纤维素释放1.0 μmole葡萄糖。

3.13 最终测定浓度:在5.00 ml反应混合物中,最终浓度为40 mM乙酸钠、4%(w/v)Sigmacell和2-6单位纤维素酶。


 4. 讨论

不适用


 5. 责任

经过培训的分析服务、新产品支持和研发人员有责任遵循本书面程序进行操作。


 6. 安全

请参见有害物质的安全数据表(SDS)和适当的操作处理注意事项。


 7. 程序步骤

7.1 试剂

 

产品编号 描述
S8625 乙酸钠,三水合物
H3162 1 N盐酸
S3504 Sigmacell微晶20型
G3293 葡萄糖(HK)测定试剂


7.2 材料 / 设备

 

一次性硅硼玻璃培养管
容积可调空气置换式移液器和吸头
天平
涡旋机
摇床
37ºC培养箱
分光光度计
分光光度计比色皿
离心机


7.3 相关操作程序
不适用

7.4 溶液制备

7.4.1   50 mM乙酸钠缓冲液,pH 5.0,37°C

7.4.1.1   用1.36 g乙酸钠三水合物(产品编号:S8625)在去离子水中制备200 ml溶液。在37℃下,用1N HCl(产品 编号:H3162)将pH值调节为5.0。

7.4.2   5%(w/v)Sigmacell溶液(Sigmacell)

7.4.2.1   用5 g Sigmacell微晶20型(产品 编号:S3504)在50 mM乙酸钠缓冲液中制备100 ml溶液。轻轻混合并加热,使悬浮液均匀。

7.4.3   葡萄糖(HK)测定小管

7.4.3.1    使用葡萄糖(HK)测定试剂(产品 编号:G3293)。按照标签说明溶解内容物。

7.4.4   纤维素酶溶液(纤维素酶)

7.4.4.1    在使用前,立即在冷的去离子水中制备含2-6单位/ml纤维素酶的溶液。

7.5 测试方法

7.5.1   移取(以毫升计)以下试剂至一次性硅硼玻璃培养管中:

 

试剂 测试 空白
Sigmacell 4.00 4.00

 

7.5.1.1    平衡至37°C。

7.5.1.2    然后添加:

 

试剂 测试 空白
纤维素酶 1.00 ----
去离子水 ---- 1.00

 

7.5.1.3    立即涡旋混合测试和空白试剂。使用摇床以中速在37℃下孵育测试和空白试剂120分钟。

7.5.1.4    立即将测试和空白试剂转移到冰浴中。静置每个管,直到悬液沉淀。以约4000 rpm速度离心约2分钟以澄清。使用步骤7.5.2.2中的上清液。

7.5.2   移取(以毫升计)以下溶液至适当的比色皿:

 

试剂 测试 空白
葡萄糖(HK)测定小管 3.00 3.00

 

7.5.2.1    平​​衡至25ºC。使用适当恒温的分光光度计监测A340nm直至恒定。记录测试和空白试剂的初始A340nm

7.5.2.2    然后添加:

 

试剂 测试 空白
测试上清液(步骤7.5.1.4) 0.10 ----
空白上清液(步骤7.5.1.4) ---- 0.10

 

7.5.2.3    立即倒置混合,并记录A340nm的增加直至完成(约5分钟)。获得测试和空白试剂的最终A340nm

7.6 计算

7.6.1    ΔA340nm 测试 = A340nm 测试最终 – A340nm 测试最初

7.6.2    ΔA340nm 空白 = A340nm 空白最终 – A340nm 空白最初

 

7.6.3

单位/ml酶 =

(ΔA340nm 测试 – ΔA340nm 空白) (3.1) (5) (DF)

(6.22) (2) (1) (0.1)

 

7.6.3.1    3.1 = 步骤7.5.2的最终体积(以毫升计)

7.6.3.2    5 = 步骤7.5.1的反应混合物的总体积(以毫升计)

7.6.3.3    DF = 稀释因子

7.6.3.4    6.22 = 在340 nm处的毫摩尔β-NADH消光系数

7.6.3.5    2 = 根据单位定义,从2小时换算成1小时的换算系数

7.6.3.6    1 = 步骤7.5.1中使用的纤维素酶的体积(以毫升计)

7.6.3.7    0.1 = 步骤7.5.2中使用的步骤7.5.1的体积(以毫升计)

 

7.6.3.8

单位/mg固体 =

单位/mL酶

mg固体/ml酶


 8. 参考文献和附件

8.1 附件:报告表

8.2 参考文献:Worthington, C.E. (1988) Worthington Enzyme Manual, pp76-79, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ


 9. 审批

对本文件的审核、批准和签名将使用DocCompliance (QUMAS) 以电子方式生成。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“使用版”。


 材料