胆固醇氧化酶的酶学测


 1. 目标

本操作程序旨在标准化胆固醇氧化酶的酶学测定实验方案。


 2. 范围

本操作程序适用于所有具有胆固醇氧化酶活性规格的产品。本测定法不适用于测定来自裂褶菌(Schizophyllum commune)(已停产的产品编号:C7274)和短杆菌属(Brevibacterium sp.) (已停产的产品编号:C8153)的胆固醇氧化酶。


 3. 定义

3.1 ODA — 邻联茴香胺

3.2 POD — 过氧化物酶

3.3 纯水 = 来自去离子系统的水,电阻率 >= 18MΩ•cm @25ºC。

3.4 过氧化物酶单位定义 — 一个单位将在pH 6.0、20℃下,在20秒钟内形成1.0 mg红陪酚。


 4. 讨论

胆固醇 + O2    胆固醇氧化酶   > H2O2 + 4-胆甾烯-3-酮 
H2O2 + 邻联茴香胺 (还原)    POD    > 2 H2O + 邻联茴香胺 (氧化)


 5. 责任

经过培训的分析服务实验室人员有责任遵循本书面实验方案。


 6. 安全

请参见有害物质的安全数据表(SDS)和适用的操作处理注意事项。


 7. 程序步骤

7.1 条件: 
T = 25°C, pH = 7.5, A500nm, 光程 = 1 cm

7.2 方法: 
连续分光光度速率测定。

7.3 试剂:

7.3.1    50 mM磷酸钾缓冲液,pH 7.5,25°C(缓冲液) 
            在纯水中制备6.8 mg/ml磷酸钾(产品编号:例如P5379)溶液。25°C下,用1 M KOH调节至pH 7.5。

7.3.2    1%(w/v)邻联茴香胺溶液(ODA) 
            在试剂7.3.1(缓冲液)中制备10.0 mg/ml邻联茴香胺(产品编号:例如D9154)溶液。(新鲜制备

7.3.3    0.5%(w/v)胆固醇与10%(w/v)Trition X-100溶液(胆固醇) 
            最初将500 mg胆固醇(产品编号:例如C8503)溶于10 ml Triton X-100(产品编号:例如X-100)中。(Triton是Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.的注册商标)。边搅拌边加热至溶液澄清。然后缓慢加入90 ml温热至70-80℃的纯水。继续在70-80℃下搅拌溶液10分钟。加入水后溶液可能会变浑浊,但仍可用于测定。

7.3.4    过氧化物酶溶液(POD) 
            在即将使用前,在纯水中制备100连苯三酚单位/ml过氧化物酶(产品编号:P8250)溶液。

7.3.5    胆固醇氧化酶溶液() 
            在即将使用前,在冷的试剂7.3.1(缓冲液)中制备含有0.1-0.2单位/mL胆固醇氧化酶的溶液。

7.4 测试方法

7.4.1    将下列试剂(以毫升计)移液到合适的容器,以制备反应混合物:

    试剂7.3.1(缓冲液)         40.00    
    试剂7.3.2 (ODA)         0.50    


7.4.2    涡旋彻底混合,然后在25℃下用0.1 M HCl或KOH调节至pH7.5(如果需要的话)。将试剂7.3.1加入到50 ml的最终体积中,涡旋充分混合,并在使用前充氧约10分钟。 7.4.3    将下列试剂(以毫升计)移入合适的比色皿:
 

测试 空白
反应混合物 2.70 2.70
试剂7.3.3 (胆固醇) 0.10 0.10
试剂7.3.4 (POD) 0.10 0.10


7.4.4    倒置混合,并在适当恒温的分光光度计中平衡至25℃。监测A500nm直到恒定。然后添加:
 

试剂7.3.1(缓冲液) ----- 0.10
试剂7.3.5( 0.10 -----


 立即通过倒置混合,并记录A500nm的增加约5分钟。使用测试、空白溶液的最大线性速率得到ΔA500nm/分钟。

7.5 计算

7.5.1 单位/ml酶 =  (ΔA500nm/min 试样 - ΔA500nm/min 空白样)(3.0)(df) 
(7.5)(0.10)

  式中: 
     3.0 = 测定的总体积(以毫升计) 
     df = 稀释因子 
     7.5 = 500 nm处氧化邻联茴香胺的毫摩尔消光系数 
     0.1 = 所使用的酶的体积(以毫升计)

7.5.2 单位/mg固体 = 单位/mL酶 
mg固体/ml酶

7.5.3 单位/mg蛋白质 =  单位/mL酶
mg固体/mg s 酶

  7.6 单位定义  7.6.1    在pH7.5、25℃下,一个单位每分钟将1.0 μmole胆固醇转化为4-胆甾烯-3-酮。 7.6.2    注意:4-胆甾烯-3-酮可能会发生异构化。 7.7 最终测定浓度: 
在3.0 ml反应混合物中,最终浓度为:46 mM磷酸钾,0.009%邻联茴香胺,0.017%(w/v)胆固醇,0.33%(v/v)Triton X-100,10单位过氧化物酶,和0.01 - 0.02单位胆固醇氧化酶。


 8. 参考文献和附件

8.1 替换SPCHOL04。

8.2 Masurekar, P.S. and Goodhue, C.T. (1978) 美国专利号4,093,717, Eastman Kodak Company, Rochester, NY.


 9. 审批

对本文件的审核、批准和签名将使用EDMS以电子方式生成。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“使用版”。


 材料