(N-(3-[2-Furyl]acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala) 底物酶促检测胶原酶 (EC 3.4.24.3)

 描述

本操作步骤可用于胶原酶产品。

分光光度法连续速率测定(A345,光程 = 1 cm) 基于以下反应:

本操作步骤可用于胶原酶产品。

 

其中:

FALGPA = N-(3-[2-Furyl]acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala,即N-(3-[2-呋喃基]丙烯酰)-亮氨酰-甘氨酰-脯氨酰-丙氨酸

FAL = N-(3[2-Furyl]acryloyl)-Leu,即N-(3[2-呋喃基]丙烯酰)-亮氨酸

单位定义:在pH 7.5、25 °C条件下,钙离子存在时,一单位胶原酶每分钟水解1.0 µmol FALGPA。


 所需的试剂和设备

FALGPA (Catalog Number F5135)
三(羟甲基)甲基甘氨酸(货号T0377

5.0 M 氯化钠溶液(货号S6546

1 M 氢氧化钠溶液(货号S2567

1 M 氯化钙溶液(货号21115

1 M 盐酸溶液(货号H3162

FALGPA(货号F5135


 注意事项

有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据说明书。


 制备说明

用超纯水(25°C下电阻率≥18 MΩxcm)配制试剂。

缓冲液(50 mM 三(羟甲基)甲基甘氨酸混合10 mM 氯化钙和400 mM氯化钠,25°C、pH 7.5) – 用合适的烧杯称量 ~2.24g三(羟甲基)甲基甘氨酸(货号 T0377)。加入200 ml超纯水。再加入 20ml 5.0M氯化钠溶液(货号 S6546)。均匀混合,然后用1–5 M NaOH 或 HCl将溶液pH值在25°C调到7.5。pH调好后,加入25ml 100mM氯化钙溶液(货号21115)。加入纯水定容到250ml。如有必要,用1–5 M NaOH 或 HCl将pH值在25°C下调至7.5。

FALGPA溶液(1.0 mM N-(3-[2-Furyl]acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala) – 用缓冲液溶解的N-(3-[2-Furyl]acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala(货号F5135)配制校正0.48mg/ml(1.0mM)溶液。根据所用特定批次FALGPA的含水量校正浓度。至少搅拌半小时以使溶液完全溶解。如有必要,用1M 氢氧化钠溶液(货号S2567)或1M 盐酸溶液(货号 H3162)将pH值在25°C下调至7.5。

酶液 – 现配现用,使用2-8°C的超纯水配制含2单位/ml胶原酶的溶液。


 操作步骤

3.00 ml反应混合液的最终浓度为48.3 mM 三(羟甲基)甲基甘氨酸、9.67 mM 氯化钙、387 mM 氯化钠、0.967 mM FALGPA和0.20 单位胶原酶。

1. 移液吸取以下试剂到适宜的容器中:
 

试剂 空白样(ml) 试样1(ml) 试样2(ml) 试样3(ml)
FALGPA 溶液 2.90 2.90 2.90 2.90
超纯水 0.10

2. 倒置混匀并用适宜的恒温分光光度计平衡到25°C。

3. 然后加入:

 

试剂 空白样(ml) 试样1(ml) 试样2(ml) 试样3(ml)
酶溶液 0.10 0.10 0.10

4. 立即倒置混匀,并记录5分钟内的A345增量。采集4个以上间隔至少一分钟的数据点,得到所有试样和空白的最大线性斜率(ΔA345/min)。


 结果

计算

1.

                                                  单位/ml 酶 =
(ΔA345/min 试样 – ΔA345/min 空白样) (3.00) (df)
----------------------------------------------------------------------
(0.53) (0.10)

其中:
3.00 = 反应混合物的总体积(ml)
df = 稀释系数
0.53 = 经Sigma-Aldrich实验测定,FALGPA在345nm处的毫摩尔消光系数。与每毫摩尔FALGPA在345nm处吸光度的最大降幅直接相关。
0.10 = 使用的酶液体积(ml)

2.

                                                         单位/mg 固体  = 单位/mL 酶
--------------------
mg固体/mL酶


 材料

     


 参考文献

  • Van Wart, H.E., and Steinbrink, D.R., Analytical Biochemistry, 113, 356-365 (1981).

04/17-1