酯酶的酶促测定


 1. 目标

建立使用丁酸乙酯作为底物对酶促测定酯酶活性的标准化方法。


 2. 适用范围

此实验操作适用于所有具有Sigma-Aldrich Saint Louis酯酶活性规格的产品。


 3. 定义

3.1. 纯水 - 来自去离子系统的水,电阻率~18MΩּcm@ 25°C

3.2. 活力单位定义 - 一个单位可在pH8.0,25ºC下每分钟将1.0μmole丁酸乙酯水解成丁酸和乙醇


 4. 讨论

丁酸乙酯+ H2   酯酶   >丁酸+乙醇


 5. 责任

所有经培训的分析服务人员都有责任遵循该书面实验步骤。


 6. 安全

有关危险和适当的操作注意事项,请参阅安全数据说明书(SDS)。


 7. 操作步骤

7.1. 条件
T = 25℃,pH 8.0

7.2. 方法
滴定速率测定

7.3. 试剂:

7.3.1 10mM硼酸盐缓冲液(缓冲液) 
使用硼酸(例如Sigma-Aldrich货号B0252)在纯水中制备0.62 mg/mL溶液。用1N NaOH将pH调节至8.0

7.3.2 丁酸乙酯(EB Neat) 
使用丁酸乙酯(例如Sigma-Aldrich货号E15701)进行制备。

7.3.3 标准化氢氧化钠 
使用1N氢氧化钠(例如Sigma-Aldrich货号S2567)在纯水中制备合适的稀释液。根据Sigma-Aldrich操作步骤进行标准化,PROC-DEK-OP-002861。

7.3.4 0.01N氢氧化钠滴定液(NaOH) 
使用标准化的试剂7.3.3在纯水中制备0.01N氢氧化钠溶液。须现配现用。

7.3.5 酯酶溶液() 
在使用前,立即在冷试剂7.3.1中制备含约50单位/ml的溶液。

7.4.操作步骤

7.4.1.   将以下试剂(以毫升计)移液到合适的滴定容器中,并同时使用合适的pH计、磁力搅拌器和恒温水浴:
 

  试样
试剂 7.3.1(缓冲液 25.0

7.4.2. 在搅拌条件下于25℃进行平衡。然后加入(以毫升计):
 

试剂 7.3.2
(EB Neat)
0.100

7.4.3. 在搅拌条件下于25℃进行平衡。使用试剂7.3.4(NaOH)将pH调节在8.1-8.2的范围内。然后加入(以毫升计):
 

试剂 7.3.5
0.100

7.4.4. 监测反应混合物的pH,直至pH达到8.0。此时,在累积模式下使用计时器,同时添加0.100ml试剂7.3.4.(NaOH)并启动计时器。(如步骤7.4.6所述,可根据需要调整NaOH滴定剂的等分试样)

7.4.5.当反应混合物的pH值再次达到8.0时,再加入0.100ml试剂7.3.4(NaOH)的等分试样(或与7.4.4中所使用的相同体积),并记录所经过的时间。

7.4.6. 重复步骤7.4.4和7.4.5约5分钟。在此期间应该添加大约10次滴定剂。并且至少需要添加5次滴定剂。如果未满足最低添加要求,请调整步骤7.4.4和7.4.5中使用的滴定剂体积。

7.4.7. 将所用滴定剂的体积(以毫升计)与时间(以分钟计)进行作图,并确定每个样品和对照组图的斜率。

7.4.8. 按照步骤7.4.1至7.4.4进行空白实验,用纯水(酶稀释剂)替换酶等分试样。如果反应混合物的pH在60分钟内没有达到8.0,则将记录60分钟作为空白速率。该时间(Tb)需用于计算。空白实验可在样品之前进行。如果空白速率几乎可以忽略不计,则可以使用另一个计时器并将空白反应混合物放在一边。但应在样品实验之间定期检查pH值。

7.5. 计算

7.5.1. 斜率可通过将试剂7.3.4(NaOH)的0.100ml(或步骤7.4.4和7.4.5中使用的体积)等分试样的消耗速率除以时间获得。
 

空白样速率修正:T (m) - (VT / Tb)

 

     7.5.2. 单位/ml酶= (T) x (NNaOH) x (1000)
-----------------------
(0.001)

 

VT = 用于将反应混合物的pH保持在8.0所需试剂7.3.4(NaOH)的体积(以毫升计)
NNaOH = 试剂7.3.4(NaOH)的一般工作浓度
1000 =从毫摩尔转换为微摩尔的转换比例
m = 从7.5.1中所得的斜率
Tb = 从7.4.8中所得的空白组经过时间
0.1 = 使用的酶的体积(以毫升计)

7.5.3. 单位/mg固体= 单位/mL酶
----------------
mg固体/mL酶

 

7.5.4. 单位/mg蛋白 = 单位/mL酶
------------------
mg蛋白/mL酶

 

7.6 初始分析浓度
在25.200ml反应混合物中,初始浓度为10mM硼酸盐、0.4%(v/v)乙酸丁酯和5单位酯酶。


 8. 参考文献和附件

8.1. 替换PEETHY02。

8.2. Adler, A.J. and Kistiakowsky, G.B. (1962) Journal of the American Chemicals Society 84, 695-703.


 9. 审批

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