葡萄糖氧化酶的酶学测定


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源自操作程序SPGLUC01。其中包含对当前SOP规范的模板更新,并纳入了一些注释。请参见CR SOP-DEK ENZ 36。


 1. 目标

本操作程序旨在标准化葡萄糖氧化酶的酶学测定实验方案。


 2. 范围

本操作程序适用于所有具有葡萄糖氧化酶活性规格的产品。


 3. 定义

3.1    纯水 = 来自去离子系统的水,电阻率 >= 18MΩ•cm @25ºC。

3.2    GOD = 葡萄糖氧化酶

3.3    POD = 过氧化物酶

3.4    葡萄糖氧化酶的单位定义 = 在pH 5.1、35℃下,一个单位每分钟将1.0 μmole的β-D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸内酯和H2O2(相当于每分钟摄取22.4 μl的O2)。如果反应混合物中的氧气达到饱和,则活性可增加至多100%。


 4. 讨论

β-D-葡萄糖 + O2 + H2O   GOD   > D-葡糖酸-1,5–内酯 + H2O2
H2O2 + 邻联茴香胺(还原)   POD   > 邻联茴香胺(氧化)


 5. 责任

所有分析服务人员有责任遵循本书面实验方案。


 6. 安全

请参见有害物质的安全数据表(SDS)和适当的操作处理注意事项。


 7. 程序步骤

7.1    条件:
T = 35°C, pH = 5.1, A, 光程 = 1 cm

7.2    方法:连续分光光度速率测定。

7.3    试剂

7.3.1.    50 mM醋酸钠缓冲液,pH 5.1,35ºC(缓冲液
使用醋酸钠三水合物(Sigma-Aldrich产品编号:S8625),在用氧饱和的纯水(使水饱和5分钟,然后在测定之前静置过夜)中制备500 ml。35ºC下,用1 M HCL调节至pH 5.1。

7.3.2    0.21 mM邻联茴香胺溶液(o-DDH)
使用琥珀色小管或其他已避光保护的小管,将20 mg邻联茴香胺二盐酸盐(Sigma-Aldrich产品编号:D9154Sigma-Aldrich产品编号:F5803)溶于8 ml氧气饱和的纯水中。然后用试剂7.3.1将5.35 ml稀释至200 ml。

7.3.3    10%(w/v)β-D-(+)葡萄糖底物溶液
使用β-D-(+)葡萄糖(Sigma-Aldrich产品编号:G5250)在纯水中制备60 ml。

7.3.4    0.17 mM 邻联茴香胺和1.72%(w/v)葡萄糖溶液(反应混合物
在即将使用前,将192 ml试剂7.3.2与40 ml试剂7.3.3混合,制备232 ml。平衡至35ºC,必要时用1 M HCL调节pH至5.1。现制现用。

7.3.5    过氧化物酶溶液(POD
在即将使用前,在冷的纯水中制备含有60 红棓酚单位/ml POD II 型的溶液。

7.3.6    葡萄糖氧化酶溶液(GOD
对于所有葡萄糖氧化酶产品(粗制品和液体产品除外),在冷缓冲液中制备20-40单位/ml的初始溶液。然后在即将使用之前,用冷缓冲液进一步稀释至0.4-0.8单位/ml(此时为零时间)。将初始溶液置于冰上。在冷缓冲液中进行新的第二次稀释,并在60分钟后再进行一次(此时为60分钟时间)。对于所有粗制品和液体产品,请参见下表。

 

粗制品和液体产品 首次稀释 二次稀释
G1262 0.2 mg/ml 无需进一步稀释
G6766 0.2 mg/ml 无需进一步稀释
G6125 2.0 mg/ml 0.1 ml+6.4 ml缓冲液
G6641 1.0 mg/ml 0.1 ml+5.0 ml缓冲液
G9010 0.1 ml+5.0 ml缓冲液 0.1 ml+3.0 ml缓冲液
G2133 0.1 mg/ml 0.1 ml+5.0 ml缓冲液
G7016 0.2 mg/ml 0.1 ml+5.0 ml缓冲液
G7141 0.1 mg/ml 0.1 ml+5.0 ml缓冲液
G7779 (1.0 mg/ml) 0.1 ml+0.5 ml缓冲液 0.1 ml+5.0 ml缓冲液
G7779 (0.01 mg /ml) 不稀释(Neat) 1.0 ml+3.0 ml缓冲液

7.4    测试方法

7.4.1    移取以下试剂到合适的比色皿中:

  测试 空白
7.3.4(反应混合物) 2.9 2.9
7.3.5 (POD) 0.1 0.1

7.4.2    然后添加:

 

7.3.6 (GOD) 0.1 -----
7.3.1 (缓冲液) ----- 0.1

 

7.4.3    立即通过倒置混合,并记录A500nm/min的增加6分钟。使用最少1.0分钟时间段和至少4个A500nm数据点获得测试和空白试剂的最大线性速率。

7.5 计算

 

7.5.1 单位/ml酶 = (ΔA500nm/min测试 - ΔA500nm/ min空白) * (3.1) * (df)
(7.5) * (0.1)

 

     3.1 = 测定的体积(以毫升计)
     df = 稀释因子
     7.5 = 500 nm处氧化邻联茴香胺的毫摩尔消光系数
     0.1 = 所使用的酶的体积(以毫升计)

 

7.5.2

单位/mg固体 =

单位/mL酶

mg固体/mL酶

 

7.5.3

单位/mg蛋白 =

单位/mL酶

mg蛋白质/mL酶

7.6    最终测定浓度:在3.10 ml反应混合物中,最终浓度为48 mM醋酸钠,0.16 mM邻联茴香胺,1.61%(w/v)葡萄糖,和6单位过氧化物酶(葡萄糖氧化酶的浓度将随所使用的产品的不同而不同)。


 8. 参考文献和附件

Bergmeyer, H.U.,Gawehn, K. and Grassl, M. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U. ed) Volume I, Second Edition, 457-458, Academic Press, Inc., New York, NY


 9. 审批

对本文件的审核、批准和签名将使用DocCompliance (QUMAS) 以电子方式生成。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“使用版”。


 材料