透明质酸酶的酶法测定 (3.2.1.35)


 说明

该程序描述了透明质酸酶活性的比浊测定法(600 nm 处的透光率 %,光路 =1 cm)。它基于以下反应:
 

             透明质酸酶

透明质酸------------------>二糖和单糖 + 较小的透明质酸片段

单位定义:一个单位的透明质酸酶活性在 pH 5.35,在 37°C,2.0 ml 反应混合物(45 分钟测定)中将引起每分钟 0.330 的 A600 变化,。


 所需试剂和设备

5.0 M 磷酸二氢钠溶液(货号 74092

透明质酸(货号 H7630 H5388

0.5 M 磷酸氢二钠溶液(货号 94046

5.0 M 氯化钠溶液(货号 S6546

牛血清白蛋白(货号 A4503

醋酸钠(货号 S8625

乙酸(货号 695092

比色皿

注意事项——有关危害和安全操作规范的信息,请参阅安全数据表。


 准备说明

使用超纯水(25℃ 时电阻率≥18mΩ×cm)配制试剂。

磷酸盐缓冲液(300 mM 磷酸钠,pH 5.35,37°C)——使用 5.0 M 磷酸二氢钠溶液(货号 74092)在超纯水中配制 1:16.7 稀释液。用 1m NaOH 或 1m HCl 在 37℃ 调节 pH 至 5.35。

透明质酸溶液 [0.03% (w/v)]

  1. 使用透明质酸(货号 H7630H5388)在磷酸盐缓冲液中配制 0.3 mg/ml 溶液。

  2. 搅拌下将溶液加热至 90-95°C,直至透明质酸溶解。这种材料需要 15 到 30 分钟的加热和搅拌才能完全溶解。不得煮沸。

  3. 溶解后,让溶液在水浴中冷却至 37℃。使用超纯水调节溶液至原始体积。用 1m NaOH 或 1m HCl 在 37℃ 调节 pH 至 5.35。

酶稀释剂 [20 mM 磷酸钠与 77 mM 氯化钠和 0.01% (w/v) 牛血清白蛋白,pH 7.0,37°C] - 制备 200 mL:

  1. 加入 8.46 mL 0.2 M 磷酸二氢钠(使用货号 74092 的产品在超纯水中制备)。

  2. 在超纯水中加入 11.54 mL 0.2 M 磷酸氢二钠(使用货号 94046 的产品制备。

  3. 加入 3.08 mL 5.0 M 氯化钠溶液(货号 S6546)。

  4. 加入 20 mg 牛血清白蛋白(货号 A4503)。

  5. 加入超纯水补足至最终体积。

  6. 用 1 MNaOH 或 1 MHCl 在 37°C 调节 pH 至 7.0。


酸性白蛋白溶液 [24 mM 乙酸钠,79 mM 乙酸,含 0.1% (w/v) 牛血清白蛋白,25°C pH 3.75] – 制备 150 mL:
 

  1.  加入 3.6 mL 储备液 1.0 M 乙酸钠,pH 4.8,溶液(使用货号 S8625的产品制备)。

  2. 加入 0.68 mL 乙酸(货号 695092)。

  3. 加入 150 mg 牛血清白蛋白(货号 A4503)。

  4. 加入超纯水补足至最终体积。

  5. 用 5 MHCl 在 25°C 调节 pH 至 3.75。
     

酶液(透明质酸酶)——临用前,在冷酶稀释液中配制 1000 单位/ml 酶原液。用冷的酶稀释液稀释酶原液,得到 ~6 单位/ml 的工作液。


 方案

最终测定浓度——在 2.0 ml 反应混合物中,最终浓度为 0.015% (w/v) 透明质酸、150 mM 磷酸钠和 2-5 单位透明质酸酶。
注:将所有测试物和空白交错至少 30 秒,以便在室温下孵育之前有足够的时间通过倒置混合每份测试物和空白。
 

1. 将下列试剂移至合适的容器中:

 

试剂 试验 1 (ml) 试验 2 (ml) 试验 3 (ml) 试验 4 (ml) 试验 5 (ml) 试验 6 (ml) 空白 (ml)
酶溶液 0.750 0.665 0.585 0.500 0.415 0.335 0.00
酶稀释液 0.250 0.335 0.415 0.500 0.585 0.665 1.00


2. 涡旋混合并平衡至 37°C,保持 10 分钟。然后添加:


试剂 试验 1 (ml) 试验 2 (ml) 试验 3 (ml) 试验 4 (ml) 试验 5 (ml) 试验 6 (ml) 空白 (ml)
透明质酸溶液 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

 

3. 旋流混匀,37°C 培养  45 分钟。

4. 45 分钟后,将各测试物和空白的 0.5ml 转移到含有 2.5ml 酸性白蛋白溶液的合适比色皿中  
    并通过倒置立即混合。  

5.  让每个比色皿在室温下静置 10 分钟。  
     注:如果孵育时间不是 10 min,结果将发生显著变化。

6.  测定 600 nm 处的 % 透射率。  

  • 将分光光度计与空白对齐。读取测试和空白的 % 透射率。
    注:将样品一起分批时,将分光光度计与准备好的相应空白溶液进行空白测试。
  • 每次测试的未校正 % 透射率 必须130–170% 之间。每个测试至少需要三 有效值才能计算活性。
    注:可调节酶溶液的浓度,使结果在有效透过率 % 范围内。


 结果


计算

1.

                               (%T 测试物 –%T 空白)(df)
单位/ml 酶 =        -------------------------------------------------
                                       (14.84)(ml 酶液)

 

其中:
df= 酶的稀释倍数
14.84=Sigma-Aldrich 测定的消光系数
ml 酶溶液 = 反应所用酶溶液的体积

 

2.                         


 材料