转化酶的酶分析

 1. 目的

目的:建立转化酶的酶学测定方法。
 

 2. 范围

本规程适用于Sigma-Aldrich Saint Louis的转化酶酶学测定相关的所有产品。
 

 3. 定义

3.1. 纯化水——去离子水,电阻率 ~18MΩ•cm@25ºC

3.2. 单位定义——一个单位在 55ºC pH 4.5 下每分钟将 1.0 μmole 的蔗糖水解为转化糖
 

 4. 讨论

蔗糖 +H 2 O    转化酶   > 葡萄糖 + 果糖
葡萄糖和果糖都被测定为还原糖。
 

 5. 责任

所有经过培训的分析服务人员都有责任按照书面程序进行操作。
 

 6. 安全

有关危险和合理的预防措施,请参阅安全数据表 (SDS)。
 

 7. 规程

7.1. 条件:T=55ºC,Abs410,pH=4.5,光程 =1 cm

7.2 方法:
分光光度终止反应

7.3 试剂

7.3.1.1 00 mM 乙酸钠,pH 4.5, 55ºC(缓冲液) 
在纯化水中配制 13.6 mg/mL 的醋酸钠三水合物,Sigma-Aldrich 产品编号为 S8625 。用 1M HCl 调节 pH 至 55ºC。

7.3.2. 1.0%w/v 蔗糖底物(蔗糖) 
在试剂7.3.1.中制备一份 10 mg/ml 的蔗糖溶液,Sigma-Aldrich 产品编号为S7903新鲜制备。

7.3.3. 转化酶() 
临用前,在冷纯化水中配制含有 0.3-0.4 单位/ml 转化酶的溶液。建议:为了增加样品的溶解度,称量产物到wig-l-bug中并相应地稀释。

7.3.4. 0.5 MNaOH (NaOH
在纯化水中配制 1:2 稀释的 1N NaOH,Sigma-Aldrich 产品编号为 S2567

7.3.5 0.5% w/v PAHBAH (PAHBAH
在试剂 7.3.4 中制备 5 mg/mL 的对羟基苯甲酰肼溶液,Sigma-Aldrich 产品编号为 H9882  。新鲜制备

7.3.6. 5.56 mM 葡萄糖标准溶液(STD SOLN) 
在纯化水中配制 1.0 mg/mL 葡萄糖标准品,Sigma-Aldrich 产品编号为 G8270

7.4 试验方法

7.4.1. 将以下内容(毫升)移入合适的容器中:
 

  测试 空白 测试 标准空白 标准品 1 标准品 2 标准品 3 标准品 4 标准品 5 标准品 6
纯化水 0.10 --- 1.00 0.95 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50
试剂 7.3.2(蔗糖 0.90 0.90 --- --- --- --- --- --- ---
试剂 7.3.6(STD SOLN --- --- --- 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50

 

7.4.2. 旋转混合并平衡至 55ºC。然后添加:
 

  测试 空白 测试 标准空白 标准品 1 标准品 2 标准品 3 标准品 4 标准品 5 标准品 6

试剂 7.3.3

--- 0.10 --- --- --- --- --- --- ---

7.4.3.   旋转混合并在 55ºC 培养 20 min。培养 20 min 后旋转并倒置试管。

7.4.4.   从各反应混合物中提取 0.10ml 并注入含有下列内容物的单独试管:
 

  测试 空白 测试 标准空白 标准品 1 标准品 2 标准品 3 标准品 4 标准品 5 标准品 6
试剂 7.3.5 (PAHBAH) 2.90 2.90 2.90 2.90 2.90 2.90 2.90 2.90 2.90

7.4.5.立即旋转混合。在每个试管上放一个大理石或透气的盖子,然后放入沸水浴中。

7.4.6.煮试管 5 min。试管可以在反应停止后15分钟内一起煮。

7.4.7.从沸水浴中取出,冷却至室温。

7.4.8.旋转混合并将溶液转移到合适的比色皿中。使用合适的分光光度计读取所有反应混合物的 Abs410。

7.5 计算

7.5.1.标准曲线:

修正后的吸光度:ΔA410nm 标准品 = A410nm 标准品 - A410nm 标准品 空白试剂

将 Δa 410 nm 标准品与葡萄糖的微摩尔量的相对关系绘制称标准曲线。

7.5.2.校正的 ΔA 410 nm 测试 =A 410 nm 测试-A 410 nm 测试空白

7.5.3.

释放的葡萄糖µmole =

(ΔA 410 nm/测试-(y-截距)

(斜率)

 

7.5.4.

单位/ml 酶 =

(µmoles 葡萄糖)(df)

(20)(0.1)(2)

其中,
df= 稀释因子
20= 测定时间(分钟)
0.1 = 使用的酶体积(毫升)
2 = 1 μmol 蔗糖水解为葡萄糖和果糖的转换因子
 

7.5.5.

单位/毫克固体 =

单位/ml 酶

mg 固体/ml 酶

7.5.7.最终测定浓度:
在 1.00 mL 反应混合物中,最终浓度为 90 mM 乙酸钠,0.90% (w/v) 蔗糖和 0.03-0.04 单位转化酶。
 

 8. 参考文献和附件

8.1. Procedure replaces SSSUCR02.

8.2. Bacon, J.S.D. (1955)Methods in Enzymology, Volume I, 258-262

8.3. Lever, M. (1972)Analytical Biochemistry, Volume 47, 273-279

8.1. 本规程替代 SSSUCR02。

8.2. Bacon, J.S.D.(1955) 酶学方法,第一卷,258-262

8.3. Lever,M. (1972) 分析生物化学,第 47 卷,273-279
 

 9. 审批

本文件的审查、核准和签字将通过电子数据管理系统以电子方式生成。如果需要带签名验证的纸质副本,打印一份“待用”副本。


 材料