漆酶的酶学测定(EC 1.10.3.2)


 1. 目标

为了标准化漆酶酶学测定的程序步骤。
 


 2. 范围

该程序步骤的范围是所有具有漆酶活性特化的产品。
 


 3. 定义

一个单位是指使用丁香醛连氮作为底物,在pH 6.5、30℃下,3 mL反应体积中每分钟产生0.001的DA530nm。
 


 4. 讨论

丁香醛连氮 + O2   漆酶   > 氧化丁香醛连氮 + 2H2O
 


 5. 责任

分析服务人员有责任遵循本书面实验方案。


 6. 安全

请参见有害物质的安全数据表(SDS)和适当的操作处理注意事项。
 


 7. 程序步骤

7.1 条件:
T = 30°C, pH = 6.5, A530nm, 光程 = 1 cm

7.2 方法:
连续分光光度测定

7.3 试剂:

7.3.1   100 mM磷酸钾缓冲液,pH 6.5,30°C(缓冲液)
(使用一元无水磷酸钾,产品编号:P5379,和去离子水,制备100 mL。在30°C下用1 M KOH调节至pH 6.5。)

7.3.2   0.216 mM丁香醛连氮溶液(SYR
(使用丁香醛连氮,产品编号:S7896,和无水甲醇,制备3 mL。)

7.3.3   漆酶酶溶液(漆酶
(在使用前,立即在冷的去离子水中制备含有25-50单位/mL漆酶的溶液。)

7.4 测试方法
将以下试剂移液到合适的小管中(以毫升计):
 

 

  测试 空白
去离子水(试剂7.3.2) ------- 0.50
缓冲液(试剂7.3.2) 2.20 2.20
漆酶(试剂7.3.2) 0.50 -------

 

平衡至30°C。使用适当恒温的分光光度计监测A530nm直至恒定。然后添加:

 

  测试 空白
SYR 0.30 0.30

反转混合,并记录A530nm的增加约10分钟。获得DA530nm/min。对测试和空白样均使用最大线性速率。

 

7.5 计算

 

单位/ml酶 =

ΔA530nm 样品 = A530nm/min 测试 - A530nm/min 空白) (df)
                                   (0.001)(0.5)

df = 稀释因子
0.001 = 在pH 6.5、30℃下,3 mL反应混合物中每单位漆酶的变化,其单位为A530nm/min
0.5 = 所使用的酶的体积(以毫升计)

 

   7.5.2.4 单位/mg固体   = 单位/mL酶
mg固体/mL酶

7.6 最终测定浓度:
在3.00 mL反应混合物中,终浓度为73 mM磷酸钾,0.02 mM丁香醛连氮,10%甲醇,和12.5至25.0单位漆酶。


 8. 参考文献和附件

Ride, J.P. (1980) Physiological Plant Pathology, 16, 187-196.


 9. 审批

 

  正楷姓名 签名 职位 日期
编写人: Gene McNaughton Gene McNaughton 起草人 09/02/03
批准人: David Lintz David Lintz 主管 09/03/03
批准人: Jeff D. Heiland Jeff D. Heiland 质量保证 09/03/03

 


 材料