溶菌酶的酶学测定(EC 3.2.1.17)

 描述

本程序步骤可用于溶菌酶产物的酶学测定。分光光度速率测定(A450,光程 = 1 cm)基于以下反应:

溶菌酶

溶壁微球菌细胞(完整) ––––––––>  溶壁微球菌细胞(已溶解)

单位定义 — 一个单位的溶菌酶在pH6.24、25℃下,使用溶壁微球菌悬液作为底物,在2.6 ml反应混合物中每分钟产生0.001 ΔA450。
 

 需要的试剂和设备

1.0 M磷酸氢钾溶液(货号:P8709

1.0 M磷酸氢二钾溶液(货号:P8584

1 M 氢氧化钾(KOH)溶液

1 M HCl溶液

溶壁微球菌,ATCC号:4698,冻干细胞(货号:M3770

注意事项

有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。
 

 制备说明

使用超纯水(25°C时 ≥ 18 MΩ×cm)制备试剂。

缓冲液(50 mM磷酸钾缓冲液,pH 6.24,25°C)— 制备550 ml:

底物悬液(0.015% [w / v] 溶壁微球菌细胞悬液)— 使用溶壁微球菌,ATCC号:4698,冻干细胞(货号:M3770)在缓冲液中制备0.15mg/ml悬液。

底物适用性:该悬液的A450必须介于0.6-0.7之间,而不是缓冲液空白。如有必要,使用适量的缓冲液或溶壁微球菌细胞调整吸光度。

酶溶液(溶菌酶) — 在使用前,立即在冷的(2-8℃)缓冲液中制备含有200-400单位/ml溶菌酶的溶液。
 

 操作步骤

1. 将以下试剂移液到合适的比色皿中并平衡至25°C,使用适当恒温的分光光度计:
 

试剂 空白 (ml) 测试1 (ml) 测试2 (ml) 测试3 (ml)
底物悬液 2.50 2.50 2.50 2.50

2. 然后添加:
 

试剂 空白 (ml) 测试1 (ml) 测试2 (ml) 测试3 (ml)
缓冲液 0.10
酶溶液 0.10 0.10 0.10

3. 立即通过倒置混合,并记录A450的降低5分钟。获得所有测试和空白样的最大线性速率(ΔA450/分钟),使用至少一分钟的时间间隔和最少4个数据点。
 

 结果

计算

1.

试中:

df =稀释因子

0.001 = 单位定义中的吸光度(ΔA450)变化

0.1 = 酶溶液的体积(以毫升计) 

 

2.

 

 材料