变溶菌素的酶促检测

描述

该操作步骤可用于变溶菌素产物。连续分光光度法(A600,光程= 1 cm)是基于以下反应:

粪链球菌细胞壁(难以溶解)  变溶菌素  可溶产物

单位定义:以粪链球菌细胞壁混悬液为底物,在1ml体积中,1单位变溶菌素在pH 6.0、37 °C条件下每分钟可产生0.01的ΔA600

 

注意事项

有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据单页。

 

所需试剂和设备

MES 水合物 (货号 M8250)
1.0 M 氯化镁溶液 (货号 M1028)
TES (货号 T1375)
变溶菌素检测底物 (货号 M3440)

 

准备说明

使用超纯水(25 °C电阻率≥18 MΩxcm)制备试剂。

缓冲液(50 mM MES缓冲液,含1mM氯化镁,在37 °C时pH 6.0)—将1.95 g MES水合物(货号M8250)溶于190 ml超纯水中,然后加入0.2 ml的1.0 M氯化镁溶液(货号M1028)。在37 °C条件下,使用1 M NaOH调整pH至6.0,然后使用超纯水将溶液总体积调整至200 ml。

酶稀释液(50 mM TES,含1 mM氯化镁,在37 °C时pH 7.0)—将2.29 g TES(货号T1375)溶于190 ml超纯水中,然后加入0.2 ml的1.0 M氯化镁溶液(货号M1028)。在37 °C条件下,使用1 M NaOH调整pH至7.0,然后使用超纯水将溶液总体积调整至200 ml。

底物(粪链球菌细胞壁混悬液)— 使用约10ml缓冲液制备对数期粪链球菌STF-3 (ATCC® 12784)细胞的细胞壁混悬液,其浓度应使A600在0.48-0.52范围内。可以根据产品数据表中的说明制备变溶菌素检测底物 (货号M3440)。

酶溶液(变溶菌素)— 使用前现配现用。使用预冷的(2–8 °C) 酶稀释剂制备含500–700单位/ml变溶菌素的溶液。

 

操作步骤

在3.04ml反应混合物中,终浓度为49 mM MES,1 mM MgCl2,0.66 mM TES和6.5–9.2单位的变溶菌素。

1.用移液器将底物转移至合适的比色皿中。
 

试剂 测试品(ml) 空白品(ml)
底物 3.00 3.00



2. 在37 °C平衡并使用适当的恒温分光光度计监测A600,直至恒定。 然后加入:
 

试剂 测试品(ml) 空白品(ml)
酶溶液 0.04

 

3. 立即颠倒混合并记录10分钟内A600的降低量。此过程持续长达1分钟,最少4个数据点,利用测试品和空白品的最大线性率获得ΔA600/分钟。

 

结果

计算

1.

单位/ml 酶= (ΔA600/分钟 测试品 – ΔA600/分钟 空白品) (3.04) (df)
(0.01) (0.04)

其中:

3.04 = 反应混合物体积(ml)

df  = 稀释系数

0.01 = 每单位每分钟的吸光度降低值

0.04 = 所用酶溶液的体积(ml)


2.

Unit/mg 固体= units/ml 酶
mg固体/ml酶

 

材料

     

   

参考文献

  • Calandra, G.B., and Cole, R.M., Infection and Immunity, 28, 1033-1037 (1980).

ATCC是American Type Culture Collection的注册商标。

03/14-1