酶促检测神经氨酸酶

(EC 3.2.1.18) N-乙酰神经胺乳糖作为底物

 

1. 目标

标准化神经氨酸酶的酶活性测定方法。

 

2. 适用范围

2.1. 该操作步骤用于可通过酶促测定法测定神经氨酸酶成分的所有产品。

2.2. 不可用于测定来自新城疫病毒的神经氨酸酶(Sigma-Aldrich货号N5146),或来自化脓性链球菌的神经氨酸酶(Sigma-Aldrich货号 N5271)。

 

3. 定义

3.1.单位定义 – 在pH 8.0、温度37°C条件下,一个单位每分钟可使用N-乙酰神经胺乳糖作为底物释放出1.0 μmole乙酰神经氨酸。

3.2 纯水 – 经去离子系统处理的水,在25ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

3.3. NANA – N-乙酰神经氨酸

 

4. 讨论

N-乙酰神经胺乳糖 + H2O    Neuraminidase   > NANA + 乳糖

5. 责任

任何分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

 

6. 安全性

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

 

7. 操作步骤

7.1 条件:

7.1.1   T = 37ºC

7.1.2   pH 5.0

7.1.3   A550nm

7.1.4   光程 = 1 cm

 

7.2 方法:

比色法

 

7.3. 试剂

7.3.1   16mM乙酸钠缓冲液,在20°C条件下的pH值为4.8

7.3.1.1   以纯水为溶剂,使用无水醋酸钠(Sigma-Aldrich货号S8750)和氯化钙二水合物制备(Sigma-Aldrich货号C3881)100 ml缓冲液。

7.3.1.2   在37°C下,使用1 M HCl调整pH至5.0。

7.3.1.3   仅来自霍乱弧菌的神经氨酸酶需要钙离子。但存在的钙离子并不会干扰其他来源神经氨酸酶的活性。

7.3.2   1.0% (w/v) N-乙酰神经胺乳糖(2→3) isomer溶液(NAN-乳糖)

7.3.2.1   采用试剂7.3.1和N-乙酰神经胺乳糖(Sigma-Aldrich 货号A3307 )制备0.85 mg/ml溶液。

7.3.2.2   此检测体系在低于底物Km值的情况下运行。2→3 isomer浓度保持0.085% (w/v)非常重要。请根据实际情况校正水和异构体含量。

7.3.3   0.2% (w/v) 牛血清白蛋白溶液(BSA)

采用纯水和牛白蛋白(Sigma-Aldrich货号 A6003)制备2 mg/ml溶液。

7.3.4   5% (w/v) 磷钨酸溶液 (PT)

采用2.5 M HCl和游离酸磷钨酸(Sigma-Aldrich货号P4006)制备50 mg/mL溶液。

7.3.5   神经氨酸酶溶液(

使用前,采用低温试剂7.3.3现配约含0.03 – 0.09 unit/ml神经氨酸酶的溶液。

7.3.6   9 M磷酸溶液(PAS)

采用纯水和磷酸(Aldrich货号215104)制备20 mL溶液。

7.3.7   200 mM过碘酸钠溶液 (Per)

采用试剂7.3.6和过磷酸钠(Sigma-Aldrich货号S1878)制备10 mL溶液。

7.3.8    含50 mM硫酸和500 mM硫酸钠溶液的10% (w/v) 亚砷酸钠溶液 (Ars)

采用纯水、亚砷酸钠(Sigma-Aldrich货号S7400)、硫酸(Aldrich货号258105)和无水硫酸钠(Sigma-Aldrich货号S9627)制备50 mL溶液。

7.3.9   含500mM 硫酸钠溶液的0.6% (w/v) 硫代巴比妥酸(TBA)
采用纯水、2-硫代巴比妥酸(Sigma-Aldrich货号T5500)和无水硫酸钠(Sigma-Aldrich货号S9627)制备200 mL溶液。

7.3.10   5% (v/v) HCl丁醇溶液(But)

将5 mL浓缩HCl(Aldrich货号258148)和95 mL n-丁醇(Sigma-Aldrich货号B0878)混合,制备溶液。

7.3.11   0.20 mM N-乙酰神经氨酸标准溶液(NANA)

采用纯水和N-乙酰神经氨酸(Sigma-Aldrich货号A2388)制备100 mL溶液。

 

7.4 酶孵育检测法

7.4.1   将下述试剂(ml)加样到适宜的容器中:

    Test
  试样 空白试样
试剂7.3.1(缓冲液 0.20 0.20
试剂7.3.2 (NAN-乳糖 0.20 0.20

7.4.2   Mix by inversion and equilibrate to 37oC. Then add:

试剂7.3.5 ( 0.10 ------
试剂7.3.3 (BSA) ------ 0.10

7.4.3   Immediately mix by inversion and incubate at 37oC for exactly 10 minutes. Then add:

试剂 7.3.4 (PT) 0.50 0.50

7.4.4   即刻倒转、低速离心3分钟混匀。

 

7.5 标准曲线

7.5.1   将下述试剂(ml)加样到适宜的容器中:

              Std
  Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5 Std 6 标准空白样
试剂7.3.11 (NANA) 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 -----
纯水 0.45 0.40 0.30 0.20 0.10 ----- 0.50
试剂7.3.4 (PT) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

7.5.2 即刻倒转、低速离心3分钟混匀。

 

7.6 显色反应

7.6.1   将下述试剂(ml)加样到适宜的容器中:

    Test             Std
  试样 空白试样 Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5 Std 6 Blank
试样上清液 0.50 ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------ ------
空白试样上清液 ------- 0.50 ------- ------- ------- ------- ------- ------ ------
Std 1上清液 ------- ------- 0.50 ------- ------- ------- ------- ------ ------
Std 2上清液 ------- ------- ------- 0.50 ------- ------- ------- ------ ------
Std 3上清液 ------- ------- ------- ------- 0.50 ------- ------- ------ ------
Std 4上清液 ------- ------- ------- ------- ------- 0.50 ------- ------ ------
Std 5上清液 ------- ------- ------- ------- ------- ------- 0.50 ------ ------
Std 6上清液 ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- 0.50 ------
标准空白样上清液 ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------ 0.50
试剂7.3.7 (Per) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10

7.6.2   倒置混匀并25°C 孵育20分钟。然后加入:

试剂7.3.8 (Ars) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00   1.00

7.6.3  涡旋直至黄棕色显色消失,然后加入:

试剂7.3.9 (TBA)
3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00

7.6.4   转移到沸水浴中孵育15分钟,冷却至室温,然后加入:

试剂7.3.10 (But) 4.60 4.60 4.60 4.60 4.60 4.60 4.60 4.60 4.60

7.6.5   振荡或涡旋溶液,直至大多数粉色成分从下层提取出来。

7.6.6   ~1000 rpm低速离心2-3分钟。

7.6.7   将上层溶液转移至适当的比色皿中,然后立即记录试样、空白试样、标准品和标准空白样的A550nm

 

7.7 计算

7.7.1 标准曲线:

7.7.1.1   ΔA550nm 标准品 = A550nm 标准品– A550nm 标准空白

7.7.1.2   绘制标准品的ΔA550nm相对N-乙酰神经氨酸微摩尔量的关系图。计算并记录斜率、y轴截距和线性回归(r2)。

7.7.2 样品测定

7.7.2.1   使用标准曲线确定释放的N-乙酰神经氨酸微摩尔量。

7.7.2.2.

  单位/mL 酶= (释放的NANA得μmole数)(df)
(0.10)(10)


df =稀释系数

0.10 = =使用的酶的体积(以毫升计)或

10 =每活力单位定义的测定时间(以分钟计)

 

7.8 最终检测浓度

在0.50 ml反应混合物中,终浓度为80 mM醋酸钠、1.6 mM氯化钙、0.034% (w/v) N-乙酰神经胺乳糖(2→3 isomer),0.04% (w/v)牛血清白蛋白,以及0.003 – 0.009神经氨酸酶。

 

8. 参考文献和附件

8.1 Schneir, M.L. and Rafelson, M.E., Jr. (1996) Biochim. Biophys. Acta. 130, 1-11.

8.2 Cassidy, J.T., Jourdia, G.W., and Roseman, S. (1965) J. Biol. Chem. 240, 3501-3506.

8.3 Warren, L. (1959) J Biol. Chem. 234, 1971-1975.

 

9. 批准

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材料