果胶酶的酶促检测

1. 目标

建立果胶酶活性测定的标准化操作步骤。
 

2. 适用范围

此操作步骤适用于 Sigma-Aldrich货号P4716P0690P2401、和 P4300
 

3. 定义

3.1 纯水=来自去离子系统的水,电阻率>或=18MÙ•cm @25ºC

3.2 单位定义=一单位能在pH 4.0、25℃下每小时从聚半乳糖醛酸中释放1.0微摩尔的半乳糖醛酸。
 

4. 讨论

聚半乳糖醛酸+ H2   果胶酶   >半乳糖醛酸
多聚半乳糖醛酸+ I2      >氧化产物
2Na2S2O3+ I2      > 2NaI + Na2S4O6
用硫代硫酸钠滴定过量的碘。
 

5. 责任

应由经过培训的分析服务实验室人员负责按照书面规定执行此操作步骤。
 

6. 安全

有关危险和适当的操作注意事项,请参阅材料安全数据手册(MSDS)。
 

7. 操作步骤

7.1 条件:
T = 25°C, pH = 4.0

7.2 方法:
滴定终止反应

7.3 试剂:

7.3.1    0.5%(w/v)聚半乳糖醛酸(Sub)

7.3.1.1 加入200 mL纯水至1.00 g至1.05g聚半乳糖醛酸,Sigma-Aldrich货号P3889 并搅拌进行制备。

7.3.1.2 搅拌,煮沸并保持沸腾五分钟。立即放入带有浸入式搅拌器的25ºC水浴中。搅拌至温度为25℃后,再搅拌溶液10分钟。

7.3.1.3 继续搅拌,并加入0.05 ml试剂7.3.6(NaOH-2)的等分试样以调节溶液的pH值,加入间隔为1分钟,直至获得4.0的pH。在搅拌条件下加入0.05ml等份的2N NaOH,直至pH保持在4.00至4.05至少10分钟。如果存在颗粒,则需通过Evergreen柱进行过滤,过滤直径最大为90 ìm。

7.3.1.4 重新检查pH值并使用试剂7.3.3(NaOH)在25℃和搅拌条件下调整至4.00-4.02。pH应保持在4.00-4.02的范围内至少30分钟。

7.3.1.5 可能需要每15分钟重新检查一次pH值,以确保在25ºC时pH值在4.00到4.02范围内。如果不在此范围内,使用0.1N NaOH对pH进行调节。
 

7.3.2  100 mM碘(I2
         使用碘量容量标准,0.1 N,Sigma-Aldrich货号318981

7.3.3  1.0 N氢氧化钠(NaOH
            使用1.0 N氢氧化钠溶液,Sigma-Aldrich货号S2567

7.3.4  1 M碳酸钠(Na2CO3
         在纯水中制备106 mg/ml的碳酸钠(试剂级),Sigma-Aldrich货号S2127

7.3.5   2.0 N硫酸(H2SO4
          在纯水中制备0.06 ml/ml的硫酸(ACS试剂),Sigma-Aldrich货号258105

7.3.6  10 N氢氧化钠(NaOH-2
          在纯水中制备400 mg/ml的氢氧化钠(试剂级), Sigma-Aldrich货号S5881

7.3.7  100 mM硫代硫酸钠,标准化(Na2S2O3
           用78.3克硫代硫酸钠(五水合物), Sigma-Aldrich货号S8503 和0.6克碳酸钠(一水合物),
       Sigma-Aldrich货号S4132在3升纯水中进行制备。使用重铬酸钾(NIST)制备的重铬酸钾标准溶液进行标准化。

7.3.8  果胶酶溶液(
           使用前在冷的纯水中制备含有约100单位/ ml的溶液。可能需要超过一分钟的旋转过程进行溶解,并且仍可能存在一些不溶性的微粒。

7.3.9  1.0%(w/v)淀粉(淀粉
           在纯水中搅拌并煮沸5分钟制备10 mg/ml的溶液。冷却至室温。使用可溶性土豆淀粉, Sigma-Aldrich货号S2004
 

7.4 试验方法

7.4.1 移取(以毫升计)以下试剂到合适的玻璃容器中,一式三份,用于对照和/或样品组:

 

  试样 空白样
试剂7.3.1(Sub) 4.90 4.90

 

7.4.2 通过旋转混合并平衡至25℃至少3分钟。然后添加:

 

试剂7.3.8( 0.100 ------

 

7.4.3 旋转混合并在25ºC下孵育试样和空白5分钟。然后添加以下内容物:

 

试剂7.3.2(I2 5.00 5.00
试剂7.3.4(Na2CO3 1.00 1.00

 

7.4.4 旋转混合,在黑暗条件下放置20.0分钟。然后添加:

 

试剂7.3.5(H2SO4 2.00 2.00

 

7.4.5 通过旋转混合,并室温放至于搅拌器上。用试剂7.3.7(Na2S2O3)滴定直到溶液呈淡黄色。然后添加以下内容物:
 

试剂 7.3.9 (淀粉) 0.10 0.10


7.4.6 搅拌后,继续用试剂7.3.7(Na2S2O3)滴定直到溶液无色。以毫升为单位记录用量。
 

7.5 计算

 

7.5.1

单位/ml酶=

(用于空白样的滴定剂毫升数 - 用于试样的滴定剂毫升数)(1)(df)(100)

(0.100)(5.0)(2)


其中:
    df =稀释因子
1 = 1微摩尔半乳糖醛酸被1等微摩尔量的I2氧化
100 = 每毫升滴定剂等微摩尔量的S2O3 
0.100 = 用于酶促反应的酶的体积(以毫升计)
2 = 每还原等微摩尔量的I2 氧化的等微摩尔量的S2O3 
5.0 = 每个定义的活性单位所需的检测孵育时间(分钟)

 

7.5.2

单位/毫克蛋白 =

单位/毫升酶

毫克蛋白质/毫升酶

 

7.6 最终测定浓度
     在5.0 mL反应混合物中,最终浓度为0.49%(w/v)聚半乳糖醛酸和10单位的果胶酶。
 

8. 参考文献和附件

8.1 Kertesz, Z. I. (1955) Methods in Enzymology.1, 162-164.

8.2 Replaces OP PEPOLY02.
 

9. 审批

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 材料