胃蛋白酶的酶分析(3.4.23.1)


 描述

本方法可用于以血红蛋白为基质测定胃蛋白酶活性。这是一种分光光度终止速率测定。

单位定义:以使用血红蛋白作为基质的三氯乙酸(TCA)可溶性产物测量,一个单位的胃蛋白酶在 37°C pH 2.0 下每分钟产生 0.001 的 ΔA280 。(最终体积 =16 mL,光路 =1 cm。)


 所需试剂和设备

1.0m 盐酸

牛血血红蛋白(目录号H2625

6.1 N\ [~100% (w/v)] 三氯乙酸溶液(目录号 T0699

注意事项

有关危险和安全操作规范的信息,请参阅安全数据表。


 准备说明

使用超纯水(25℃ 下电阻率≥18mΩxcm)配制试剂。

10 mM HCl(盐酸)– 用超纯水将 1.0 M 盐酸稀释 100 倍。

2.5% (w/v) 血红蛋白原液 – 使用  牛血血红蛋白 (目录号  H2625)在超纯水中配制 25 mg/mL 溶液。用力搅拌,形成漩涡,在37°C 下至少持续搅拌 10 分钟,然后用粗过滤器(90-130 mm)过滤聚丙烯柱。

基质[2.0% (w/v) 血红蛋白溶液] – 将 80 mL 过滤后的 2.5% (w/v) 血红蛋白原液转移到合适的容器中。使用 5 M HCl 在 37°C 下调节该溶液的 pH 至 2.0。用超纯水将最终体积加至 100 mL。

TCA 溶液[5% (w/v) 三氯乙酸] – 用超纯水稀释   6.1 N[~100% (w/v)] 三氯乙酸溶液   (目录号 T0699)20 倍。

酶溶液(胃蛋白酶)– 在冷的 (2-8°C) 10 mM HCl 中制备 1 mg/mL 的储备溶液。如果存在不溶物质,将原液置于冰上直至溶解。如果胃蛋白酶已经溶解,或者如果不溶性物质仍然存在,在 1 小时后,将 1 mg/mL 的储备溶液进一步稀释至 0.01–0.05 mg/mL 的冷的 10 mM HCl 酶溶液。


 流程

1.将基质移入合适的玻璃瓶中。

 

试剂 空白 (ml) 试验 1 (ml) 试验 2 (ml) 试验 3 (ml)
基质 5.00 5.00 5.00 5.00

 
2.将小瓶置于恒温水浴中并平衡至 37°C 约 10 分钟,然后添加:  

 

试剂 空白 (ml) 试验 1 (ml) 试验 2 (ml) 试验 3 (ml)
酶溶液 1.00 1.00 1.00


3.摇动混合并在 37ºC 培养 10 分钟(精确的),然后添加:  

 

试剂 空白 (ml) 试验 1 (ml) 试验 2 (ml) 试验 3 (ml)
三氯乙酸溶液 10.0 10.0 10.0 10.0
酶溶液 1.00


4.摇动混合并在 37°C 下再培养 5 分钟。  
 

5.通过 0.45µm 注射器过滤器过滤空白和测试混合物。使用分光光度计,记录每个小瓶中每种过滤溶液的 A280 与空气的比例。


 结果

计算
 

1.             单位/ml 酶 =          (A280  测试 –A280  空白)x (df)
                                                           (10) x (1.0) x (.001)

其中:

df= 稀释因子
10= 分析培养时间(分钟)
1.0= 加入的酶溶液体积 (ml)
0.001=ΔA280每单位胃蛋白酶(单位定义)


 材料

     


 参考文献

  1. Anson, M.L., Journal of General Physiology22, 79-89 (1938).