以过氧化物酶 (EC 1.11.1.7) 2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为基质的酶分析


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替换 SPABTS02。更新规程,以符合当前的 QUMAS 格式指南。请参阅 CR SOP-DEK-ENZ42。


 1. 目标

建立以 (EC 1.11.1.7) 2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为基质的过氧化物酶测定方法。


 2. 范围

本规程适用于所有使用 2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作为基质的具有过氧化物酶活性规格的产品。


 3. 定义

3.1.    净化水-去离子水,电阻率> 或 =18MΩ•cm@25ºC

3.2.    单位定义-一个单位在 25°C ph 5.0 下每分钟将氧化 1.0 μmole 的 2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。

3.3.    ABTS-2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。ABTS 是德国宝灵曼公司的注册商标。


 4. 讨论

H2O2 + ABTS   过氧化物酶   > 2H2O+ 氧化型 ABTS


 5. 责任

所有分析服务人员都有责任按照书面说明遵守本协议。


 6. 安全

有关危险和合理的预防措施,请参阅安全数据表 (SDS)。


 7. 流程

7.1.    条件
T = 25°C,pH = 5.0, A405nm,光路 = 1 cm

7.2.    方法
连续分光光度法测定

7.3.    试剂

7.3.1. 100 mM 磷酸钾,pH 5.0,25°C(缓冲液) 使用一元磷酸氢钾制备纯净水中的13.6 mg / ml溶液, Sigma-Aldrich 产品编号 P5379。使用 1N KOH 在 25°C 下调节该溶液的 pH 至 5.0。

7.3.2.9.1 mM ABTS(基质)使用 ABTS   (Sigma-Aldrich 产品编号 A9941)  在试剂 7.3.1 中制备 5.0 mg/mL 溶液。检查该溶液的 pH 值,必要时在 25℃ 下调节至 5.0。  Sigma-Aldrich 产品编号 A9941   以 10 mg 片剂的形式提供。新鲜制备。

7.3.3.0.3% (w/w) 过氧化氢溶液 (H2O2) 使用过氧化氢 30% (w/w) 溶液在纯化水中配制 0.3% (w/w) 溶液,   Sigma-Aldrich 产品编号 H1009 。新鲜制备。

7.3.4. 40 mM 磷酸钾缓冲液,含 0.25% (w/v) 牛血清白蛋白和 0.5% (v/v) Triton X-100,pH 6.8,25°C(稀释液)

7.3.4.1.在纯化水中配制含有以下成分的溶液:

7.3.4.1.1.5.4 mg/mL 磷酸钾,一元,  Sigma-Aldrich 产品编号 P5379

7.3.4.1.2.2.5 mg/mL 白蛋白,牛,V 级分粉末,   Sigma-Aldrich 产品编号 A4503

7.3.4.1.3.5.0 mg/mL Triton X-100,Sigma-Aldrich 产品编号 T6878。Triton 是美国联合碳化物公司的注册商标。

7.3.4.2.    使用 1N KOH 在 25°C 下调节该溶液的 pH 至 6.8。

7.3.5.    过氧化物酶酶溶液(Enzy)

7.3.5.1.    在冷试剂 7.3.4 中配制 10 mg/mL 过氧化物酶原液。

7.3.5.2.    临用前,用冷试剂 7.3.4 稀释至 0.20-0.80 单位/ml。
 

7.4.    流程

7.4.1.    将下列试剂(毫升)移入合适的比色皿中:

 

  测试 空白
试剂 7.3.2(基质) 2.90 2.90

 

7.4.2.    让比色皿在25℃下在适当恒温的分光光度计中平衡约5分钟,然后加入:

 

试剂 7.3.3 (H2O2) 0.10 0.10
试剂 7.3.4(稀释液) 0.05 -----
试剂 7.3.5.2 (Enzy) ----- 0.05

7.4.3.    立即通过反转混合并记录A405 nm 的增加,持续约3分钟。最快的速度通常在第一分钟。如果要运行多个酶水平,则一次测试一个。

7.4.4.    获得ΔA405 nm/分钟以获得测试和空白的最大线性速率。

 

7.5. 计算

 

7.5.1.

单位/毫克固体 =

(ΔA405 nm/min(测试) - ΔA405 nm/min(空白)) * 3.05 * DF

36.8 * 0.05
 

    

    3.05= 反应的最终体积(毫升)
    DF= 酶的稀释因子
    36.8 = 在A405nm处的氧化ABTS的毫摩尔消光系数
    0.05= 使用的酶体积(毫升)


7.6.    最终测定浓度
在 3.05 mL 反应混合物中,最终浓度为 96 mm 磷酸钾,8.7 mm 2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸),0.01% (w/w) 过氧化氢,0.004% (w/v) 牛血清白蛋白,0.008% (v/v) Triton X-100 和 0.01-0.04 U 过氧化物酶。
 


 8. 参考文献和附件

8.1.    Keesey, J. (1987) Biochemica Information, First Edition, pp. 58, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN

8.2.    Pütter, J. and Becker, R. (1983) Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 3rd ed., Vol III, pp. 286-293, Verlug Chemie, Deerfield Beach, FL

8.1.    Keesey,J. (1987)  《生化遗传病信息》,第一版,第 58 页,Boehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,IN

8.2.    Pütter,J. 和 Becker,R. (1983)  《酶分析的方法》 (Bergmeyer,H.U.,ed.)第三版,第三卷,第 286-293 页,Verlug Chemie,Deerfield Beach,FL


 9. 审批

将使用 DocCompliance (QUMAS) 以电子方式生成此文档的审核、审批和签名。如果需要带签名验证的纸质副本,打印一份“待用”副本。


 材料