过氧化物酶的酶学测定(EC 1.11.1.7)

 描述

该实验程序用于使用连苯三酚作为底物测定过氧化物酶的酶活性。使用该方法的产品包括但不限于:P1709P2088P6140P6782P8125P8170P8250P8375P8415P8651

连续分光光度法速率测定(A420,光程 = 1cm)基于以下反应:

单位定义:一个单位的过氧化物酶在pH 6.0、20℃下,在20秒钟内从连苯三酚形成1.0毫克红陪酚。该单位相当于25°C时每分钟约18 μM单位。

 

 注意事项

有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅材料安全数据表。

 

 需要的试剂和设备

1.0 M磷酸氢钾溶液(货号:P8709

1.0 M磷酸氢二钾溶液(货号:P8584

过氧化氢,30% (w/w) 溶液(货号:H1009

连苯三酚(货号:254002

比色皿和恒温分光光度计

 

 准备说明
(存储 / 稳定性)

使用超纯水(25°C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率)制备试剂。

磷酸盐缓冲液(100 mM磷酸钾缓冲液,pH 6.0,20°C)— 加入17.36 ml的1.0 M磷酸氢钾溶液(货号:P8709)。加入2.64 ml的1.0 M磷酸氢二钾溶液(货号:P8584),用超纯水定容至200 ml。用1 N KOH或1 N HCl在20℃下调节至pH 6.0。将磷酸盐缓冲液储存在冰上。

过氧化物溶液(0.50% [w/w] 过氧化氢 [H2O2] 溶液)— 使用过氧化氢,30% (w/w) 溶液(货号:H1009)在超纯水中制备1:60稀释液。

注意:制备新鲜稀释液用于对照和样品,并将溶液储存在加盖的4打兰小管中,置于冰上,避免暴露于空气。

连苯三酚溶液(5% [w/v] 连苯三酚溶液)— 用连苯三酚(货号:254002)和超纯水在琥珀色(或用铝箔包裹的)小管中制备50 mg/ml溶液。

注意:现配现用,并将此溶液避光保存在冰上。

过氧化物酶溶液 — 在冷的磷酸盐缓冲液中制备10 mg/ml过氧化物酶溶液。在冷的磷酸盐缓冲液中制备含有0.45-0.75单位/ml过氧化物酶的工作溶液,现配现用。

注意:10 mg/ml原液可用于RZ因子测定。

 

1. 移取以下试剂到合适的比色皿中:

试剂

空白
(ml)

测试1
(ml)

测试2
(ml)

测试3
(ml)

超纯水

2.1

2.1

2.1

2.1

磷酸盐缓冲液

0.32

0.32

0.32

0.32

过氧化物溶液

0.16

0.16

0.16

0.16

连苯三酚溶液

0.32

0.32

0.32

0.32

2. 倒置混合,并在适当恒温的分光光度计中平衡至20℃约10分钟。

注意:所有比色皿可同时孵育,但一次只读取一个比色皿。

3. 然后添加:

试剂

空白
(ml)

测试1
(ml)

测试2
(ml)

测试3
(ml)

磷酸盐缓冲液

0.1

过氧化物酶工作溶液

0.1

0.1

0.1

4. 立即通过倒置混合,并记录A420的增加3分钟。对于所有测试和空白样,使用最大线性速率或0.5分钟间隔获取DA420 / 20秒。

适用性标准:DA420 / 20秒的速率必须在0.18-0.34之间。如果需要,可以调节酶浓度。

 

 结果

计算

1.
  
式中:
3 = 测定的体积(以毫升计)
df = 稀释因子
12.0 = 1 mg/ml红陪酚在420 nm处的消光系数(内部测定)
0.1 = 使用的酶体积(以毫升计) 

 

2.    

3.

 材料

     

 参考文献

  1. Chance, B., and Maehly, A.C., Methods in Enzymology, 2, 773-775 (1955).
  2. Shannon, L.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 241, 2166-2172 (1966).