植酸酶的酶促检测(EC 3.1.3.8)


 文档记录

源自操作步骤SSPHYT02。包括模板根据现行SOP规范更新和整合注意事项到操作步骤。参阅SOP-DEK-ENZ18。


 1. 目的

测定植酸酶(货号 P9792)的活性。


 2. 适用范围

包括以下反应:
植酸 + H2O    植酸酶   > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + Pi


 3. 定义

3.1.    纯水 - 去离子系统的水,25°C下电阻率18MΩcm。

3.2.    p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP = p-肌-肌醇 1,2,4,5,6- 五磷酸

3.3.    植酸 = 肌-肌醇六(二氢磷酸)

3.4.    Pi = 无机磷酸

3.5.    植酸酶的单位定义 = 在pH 2.5、37°C下,一个单位每分钟将从4.2 X 10-2 M 植酸中释放1.0 μmol无机磷酸。


 4. 讨论

4.1.    植酸 + H2   植酸酶   > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + Pi

4.2.    方法 = 比色测定,温度(T) = 37°C,pH = 2.5, A400nm ,光程 = 1cm


 5. 责任

我们所有工作人员都有责任遵循本书面操作规程。


 6. 安全

测定开始之前,请参阅每种化学品的MSDS。


 7. 操作步骤

7.1 试剂

7.1.1 200 mM甘氨酸缓冲液,pH 2.8、37°C(Buffer)

7.1.1.1.    配制100 ml,用纯水溶解甘氨酸,盐酸,货号 G7126

7.1.1.2.     用1 M NaOH或1 M HCl将pH在37°C下调至2.5。

7.1.2.      44.1 mM植酸溶液,pH 2.5、37°C(Phytic Acid)

7.1.2.1.    配制 10 ml,试剂7.1.1溶解植酸,二钾盐,货号 P5681

7.1.2.2.     用1M HCl将pH在37°C下调至2.5。

7.1.3.     5% (w/v) 钼酸铵溶液(Amm Moly)
配制100 ml,纯水溶解钼酸,四水铵盐,货号 M0878

7.1.4 5N 硫酸溶液
配制 100 ml,纯水溶解硫酸, 95-98%, A.C.S.试剂,货号 258105

7.1.5 丙酮
丙酮, A.C.S.试剂级,货号 179124

7.1.6 显色剂(CRS)

7.1.6.1 配制100 ml,25 ml试剂7.1.3加入到25 ml试剂7.1.4和50 ml试剂7.1.5。

7.1.6.2 混匀并立即使用。

7.1.6.3 新鲜配制。

7.1.7 50 mM磷酸钾溶液(P Std.)
配制10 ml,用去离子水溶解磷酸钾,一元,无水,货号 P5379

7.1.8 植酸酶溶液(Enzyme)
现用现配,用低温试剂7.1.1配制包含0.5-2.0 单位/ml 植酸酶的溶液。

7.2.     步骤——空白/试样制备

7.2.1.     将下列试剂移液转入(按ml)一个4 dram小瓶(vial):

 

  试样 空白
试剂7.1.2 (Phytic Acid) 0.50 0.50

 

7.2.2.    平衡到37°C,然后添加:

 

试剂7.1.8 (Enzyme) 0.025 ----
试剂7.1.1 (Buffer) ---- 0.025


7.2.3.     立即倒置混匀并在37°C下孵育整整30min。然后添加

 

试剂7.1.6 (CRS) 4.00 4.00
纯水 0.025 0.025

 

7.2.4.    涡旋混匀,然后将溶液转移到适宜的容器中,使用适宜的分光光度计记录试样和空白样的A400nm

7.3.    步骤-标准曲线:

7.3.1 将下列试剂移液转入(按ml)适宜的容器中:

 

  标准样 1 标准样 2 标准样 3 标准样 4 标准样 5 标准空白样
纯水 0.04 0.03 0.02 0.01 ---- 0.05
试剂7.1.7(P Std.) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 ------
试剂7.1.2 (Phytic Acid) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50



7.3.2 涡旋混匀并在37°C下孵育30分钟。然后添加:

 

试剂7.1.6 (CRS) 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00

 

7.3.3 涡旋混匀,然后将溶液转移到合适的比色皿中,使用适宜的分光光度计记录标样和标样空白的A400nm

7.4.    计算

7.4.1 标准曲线

7.4.1.1 ΔA400nm标样 = A400nm标样 - A400nm标样空白

7.4.1.2 绘制ΔA400nm相对磷酸μmol量的标准曲线。

7.4.2 样品测定

7.4.2.1 ΔA400nm试样 = A400nm试样 - A400nm试样空白

7.4.2.2 使用标准曲线测定释放磷酸的μmol量。
 

7.5.2.3

单位/ml酶=

   (释放磷酸的µmol量)(df)

               (30)(0.025)


其中:
    df = 稀释因子
30 =每定义单位的检测时间(分钟)
0.025 = 所用酶的容积(ml)
 

7.4.2.4

单位/mg 固体 =

单位/mL 酶

mg固体/mL酶


 8. 参考文献和附件

Heinonen, J.K. and R.J. Lahti (1981) Analytical Biochemistry113, 313-317.


 9. 审批

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 材料