以酪蛋白为底物酶法测定蛋白酶

 1. 目标

为了标准化在 Sigma-Aldrich St.Louis 使用酪蛋白作为底物的蛋白酶的酶测定程序。


 2. 范围

P4630P4755, P0384, P5380P7431P6141P1512, P9040, P5147, P5647, P8775, P7026P4032P8038P8298, P2789, P4789, P6670P3910P4806,以及所有指定的杂质。


 3. 定义

3.1 单位定义——一个单位在 37ºC pH 7.5 时每分钟水解酪蛋白产生相当于 1.0 μmole 酪氨酸的颜色。颜色与 Folin 和 Ciocalteau 试剂一致。

3.2 纯化水——由电阻率 >18MΩּcm-1 的去离子系统产生的纯化水或等效物。


 4. 讨论


酪蛋白 +H2O 蛋白酶 >氨基酸


 5. 责任

所有经过培训的分析服务实验室人员都有责任按照书面程序进行操作。


 6. 安全

有关危险和合理的预防措施,请参阅材料安全数据表 (MSDS)。


 7. 规程

7.1 条件:T = 37ºC,pH=7.5,A 660 nm 光路 =1 cm

7.2 方法:分光光度终止速率测定法

7.3 试剂

7.3.1 50 mM 磷酸钾缓冲液,37ºC,pH 7.5(缓冲液
使用磷酸钾、二元三水合物和纯化水制备 11.4 mg/mL,Sigma-Aldrich 产品编号 P5504。用 1 NHCl 在 37ºC 调节至 pH 7.5。

7.3.2  0.65% (w/v) 酪蛋白溶液(酪蛋白

7.3.2.1 用酪蛋白 Sigma-Aldrich 产品编号 C7078和试剂 7.3.1(缓冲液)配制 6.5 mg/mL的溶液。

7.3.2.2 轻轻搅拌加热至 80-85ºC 约 10 min,直至达到均匀分散。不要煮沸。

7.3.2.3 必要时用 0.1 NNaOH 或 0.1 NHCl 在 37ºC 下调节 pH 至 7.5。

7.3.3 110 mM 三氯乙酸试剂 (TCA)
用纯化水制备 1:55 的三氯乙酸稀释液,6.1N,约 100% (w/v) , Sigma-Aldrich 产品编号 T0699

7.3.4  0.5 M Folin&Ciocalteu 酚试剂 (F-C)
用纯化水配制 1:4 的 2 MFolin&Ciocalteu 的酚试剂稀释液,  Sigma-Aldrich 产品编号 F9252

7.3.5  500 mM 碳酸钠溶液 (Na2CO3)
用无水碳酸钠在纯化水中配制 53 mg/mL溶液, Sigma-Aldrich 产品编号 S2127

7.3.6 10 mM 醋酸钠缓冲液,含 5 mM 醋酸钙,37ºC,pH 7.5(酶稀释液
用纯化水制备 1.4 mg/mL 乙酸钠,三水合物, Sigma-Aldrich 产品编号 S8625 ,和 0.8 mg/mL 醋酸钙, Sigma-Aldrich 产品编号 C1000。用 0.1 M 乙酸或 0.1 N NaOH 在 37ºC 调节 pH 至 7.5。

7.3.7  1.1 mM L-酪氨酸标准品 (Std Soln)
用纯化水制备 0.2 mg/mL L-酪氨酸,游离碱, Sigma-Aldrich 产品编号 T3754。缓慢加热(不要煮沸)直到酪氨酸溶解。冷却至室温。

7.3.8 蛋白酶溶液
临用前,用不惯冷试剂 7.3.6(酶稀释液)配制含 0.1-0.2 单位/mL 蛋白酶的溶液。对于预期检测到很少或没有蛋白酶的样品,在冷试剂 7.3.6(酶稀释液)中制备 10 mg 固体/mL 的样品。

 

7.4 测定规程

7.4.1 吸取以下内容到合适的小瓶中(毫升):

 

  试验 1 试验 2 试验 3 空白
酪蛋白(试剂 7.3.2) 5.00 5.00 5.00 5.00

 

7.4.2 小瓶在 37ºC 的适当恒温水浴中平衡约 5 min,然后加入:

 

酶溶液(试剂 7.3.8) 1.00 0.70 0.50 -----

 

7.4.3 旋转混匀,37ºC 下培养 10 min。然后添加:

 

TCA(试剂 7.4.3) 5.00 5.00 5.00 5.00
酶溶液(试剂 7.3.8) ----- 0.30 0.50 1.00

 

7.4.4 旋转混匀,37ºC 下培养约 30 min。

7.4.5 使用 0.45µm 注射器过滤器过滤每种溶液,并在步骤 7.4.6 中使用滤液。

7.4.6 将下列试剂移入 4 个打兰小瓶(毫升):为了得到更一致的结果,在加入 Na2CO3(试剂 7.3.5)后立即加入 F-C(试剂 7.3.4)。

 

  试验 1 试验 2 试验 3   空白  
测试滤液(步骤 7.4.5) 2. 00 2. 00 2. 00 -----
空白滤液(步骤 7.4.5) ----- ----- ----- 2. 00
Na2CO3(试剂 7.3.5) 5.00 5.00 5.00 5.00
F-C(试剂 7.3.4) 1.00 1.00 1.00 1.00

 

7.4.7 将下列试剂移液至合适的小瓶中(以毫升计),制备标准曲线。

7.4.7.1 对于杂质样品,可根据需要添加低标准品:

7.4.7.2 如需更一致的结果,请在加入 Na2CO3(试剂 7.3.5)后立即加入 F-C(试剂 7.3.4)。

 

  标准品 1 标准品 2 标准品 3 标准品 4 标准品 5 标准空白
标准溶胶(试剂 7.3.7) 0.05 0.10 0.20 0.40 0.50 0.00
纯化水 1.95 1.90 1.80 1.60 1.50 2. 00
Na2CO3(试剂 7.3.5) 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
F-C(试剂 7.3.4) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

 

7.4.8 旋转混匀,37ºC 培养空白、标准品和检测试剂 30 min。取出样品瓶,冷却至室温。

7.4.9 使用 0.45µm 注射器过滤器将每个空白、标准品和测试品过滤到合适的比色皿中。

7.4.10 记录各试验、标准品、空白溶液的 A660 nm。

7.5 计算

7.5.1 标准曲线

 

7.5.1.1.

ΔA660nm (标准品)=

ΔA 660 nm(标准品) -ΔA660 nm(标准空白)

 

7.5.1.2.

绘制 ΔA 660 nm(标准品) 对比酪氨酸 μmol 数

7.5.2 样品测定

 

7.5.2.1.

ΔA 660 nm(测试品) =

ΔA 660 nm(测试品) -ΔA660 nm(测试空白)

 

7.5.2.2.

单位/mL 酶 =

(μmole 酪氨酸当量释放)(11)

 

 

(1)(10)(2)

其中
11 = 以毫升计的测定总体积
2 = 比色测定所用的体积(毫升)
1 = 用于测定的酶体积
10 = 测定时间(分钟)

 

7.5.2.3.

单位/毫克固体 =

单位/mL 酶

 

 

mg 固体/ml 酶

 

7.5.2.3.

单位/mg 蛋白质 =

单位/mL 酶

 

 

mg 蛋白/ml 酶


7.6 最终测定浓度
在 6.00 mL 反应混合物中,最终浓度为 42 mm 磷酸钾,0.54% (w/v) 酪蛋白,1.7 mm 乙酸钠,0.8 mm 醋酸钙和 0.1-0.2 U 蛋白酶。

 

 8. 参考文献

8.1 Anson,M.L.,(1938) J.Gen.Physiol。22,79-89

8.2 Folin,O. 和 Ciocalteau,V., (1929) J. Biol.化学。73,627


 9. 审批

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 材料