超氧化物歧化酶的酶学测定

1. 目标

为了标准化酶学测定超氧化物歧化酶的操作程序。

2. 范围

本操作程序适用于酶学测定具有超氧化物歧化酶活性规格的所有产品。

3. 定义

3.1 纯水 = 来自去离子系统的水,电阻率 >= 18MΩ•cm @25ºC。

3.2 单位定义 — 在pH 7.8,温度25℃条件下,以3.0 ml反应体积,使用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶,一个单位将抑制偶合系列中细胞色素c的还原率50%。黄嘌呤氧化酶浓度应产生每分钟0.025 +/- 0.005的初始(未抑制的)ΔA550nm

3.3 XOD — 黄嘌呤氧化酶

3.4 SOD — 超氧化物歧化酶

3.5 O2¯  超氧自由基
 

4. 讨论

4.1 超氧自由基是由黄嘌呤氧化酶催化的酶促反应产物:
黄嘌呤 + O2 + H2   XOD   > 尿酸 + O2¯ + H+

4.2 氧化的细胞色素c被超氧自由基还原。用分光光度仪跟踪550nm处的还原速率:
细胞色素3+ c + O2¯∙       > 细胞色素2+ c + O2

4.3 超氧化物歧化酶通过竞争超氧自由基来抑制细胞色素c的还原:
2 O2¯ + 2 H+    SOD   > O2 + H2O2

5. 责任

经过培训的分析服务实验室人员有责任遵循本书面实验方案。

6. 安全

请参见有害物质的材料安全数据表和适当的操作处理注意事项。

 

7. 程序步骤

7.1 条件:
T = 25°C, pH = 7.8, A550nm, 光程 = 1 cm

7.2 方法:
连续分光光度速率测定。

7.3 试剂:

7.3.1    216 mM磷酸钾缓冲液,pH 7.8,25°C(缓冲液)

7.3.1.1    在纯水中制备49.3 mg/ml磷酸氢二钾三水合物(Sigma-Aldrich产品编号:P5504)溶液。

7.3.1.2    使用1 M KOH或1 M HCl在25°C下将pH调节至7.8。

7.3.2    10.7 mM乙二胺四乙酸溶液(EDTA)
            在纯水中制备4.0 mg/ml乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(Sigma-Aldrich原液产品编号:ED2SS)溶液。

7.3.3    1.1 mM细胞色素C溶液(Cyt C)
            在纯水中制备14.6 mg/ml细胞色素C(Sigma-Aldrich产品编号:C7752)溶液。

7.3.4    0.108 mM黄嘌呤溶液(黄嘌呤)

7.3.4.1    将1.64 mg黄嘌呤(Sigma-Aldrich产品编号:X0626)溶于90 ml纯水中。

7.3.4.2    一边搅拌,一边加入少量1N KOH直至所有黄嘌呤溶解。

7.3.4.3    将溶液定量转移至100 ml容量瓶中,用纯水调至100 ml。

7.3.5    黄嘌呤氧化酶溶液(XOD)

7.3.5.1    在冷的纯水中制备含有约 5单位/ml黄嘌呤氧化酶(Sigma-Aldrich产品编号:X1875)的溶液。放在冰上。

7.3.5.2    在即将用于第7.4.3节之前,立即使用试剂7.3.5.1在含有0.05单位/mL黄嘌呤氧化酶的冷纯水中制备溶液。可能需要调整该浓度以满足第7.4.3节的要求。

7.3.6    超氧化物歧化酶溶液
            在即将使用前,立即在冷的纯水中制备含有10单位/mL超氧化物歧化酶的溶液。
 

7.4 测定程序步骤

7.4.1    将下列试剂(以毫升计)移液到合适的容器,以制备反应混合物:


纯水 23.0
试剂7.3.1(缓冲液) 25.0
试剂7.3.2(EDTA) 1.0
试剂7.3.3(CytoC) 1.0
试剂7.3.4(黄嘌呤) 50.0

 

7.4.2    如有必要,在25°C下用1M HCl或1M KOH混合并调节pH至7.8。

7.4.3    黄嘌呤氧化酶检查:

7.4.3.1    将以下溶液(以毫升计)移入合适的比色皿:

 

  空白 XOD
试剂7.4.2(鸡尾酒) 2.80 2.80

 

7.4.3.2    使用适当恒温的分光光度计平衡至25°C。监测550nm处的吸光度直到恒定,然后添加:

 

纯水 0.20 0.10
试剂7.3.5.2(XOD) ----- 0.10


7.4.3.3    倒置混合,并记录550 nm处吸光度的增加约5分钟。对于该反应,与空白相比,未抑制的吸光度变化应为0.025 +/- 0.005。如果不是,则调整试剂7.3.5.2的浓度并重复第7.4.3节。
 

7.4.4    将下列试剂(以毫升计)移入合适的比色皿:


  空白 未抑制 测试-1 测试-2 测试-3
试剂7.4.2(鸡尾酒) 2.80 2.80 2.80 2.80 2.80
纯水 0.20 0.10 ----- 0.01 0.02
试剂7.3.6 (SOD) ----- ----- 0.10 0.09 0.08

 

7.4.5    使用适当恒温的分光光度计平衡至25°C。监测550nm处的吸光度直到恒定,然后添加:

 

试剂7.3.5.2(XOD) ----- 0.10 0.10 0.10 0.10


7.4.6    倒置混合,并记录550 nm处吸光度的增加约5分钟。对于未抑制的反应,以一分钟的间隔,获取最快的线性速率。使用此时间间隔,获取每个测试样和空白样的速率。

7.4.7    每个抑制测试的ΔA550nm应落在未抑制速率的40-60%之内。超出此范围的任何值均视为无效。
 

7.5 计算
 

7.5.1 抑制百分比: (ΔA550nm/min 未抑制 - ΔA550nm/min 抑制)(100)
(ΔA550nm/min 未抑制 - ΔA550nm/min 空白)

 

单位/ml酶:

(抑制百分比)(DF) (50%)(0.10)

    DF = 稀释因子
    50% = 一个定义单位抑制细胞色素c还原的速率
    0.10 = 一个测试中使用的酶的体积(以毫升计)

7.6 最终测定浓度:
在3.00 ml反应混合物中,最终浓度为50 mM磷酸钾,0.1 mM乙二胺四乙酸,0.01 mM细胞色素c,0.05 mM黄嘌呤,0.005单位黄嘌呤氧化酶和1单位超氧化物歧化酶。
 

8. 参考文献和附件

8.1 McCord, J. M. and Fridovich, I. (1969) J. Biol. Chem. 244, 6049 6055

8.2 从SOP 10-30-6299和OP SPCYTO01更新而来的操作程序。

 

9. 批准

对本文件的审核、批准和签名将使用EDMS以电子方式生成。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“使用版”。

 

 材料