胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序的描述

该程序用于使用Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)作为底物测定胰蛋白酶活性。该程序是基于以下反应的连续分光光度速率测定(A253,光程= 1cm)程序:

BAEE + H2    胰蛋白酶    > Nα-苯甲酰基-L-精氨酸 + 乙醇

式中:
BAEE — Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯

单位定义:一个BAEE单位的胰蛋白酶活性将产生每分钟0.001的ΔA253,BAEE为底物,pH值为7.6,温度为25℃,反应体积为3.20 ml。

 

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序的注意事项

有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。

 

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序需要的试剂和设备

磷酸钠,一元(货号:S0751

Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE,货号:B4500

1 M NaOH溶液

1 M盐酸(货号:318949

注意事项 — 有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。

 

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序的制备说明

使用超纯水(25°C时 ≥ 18 MΩ×cm)制备试剂。

缓冲液(67 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.6,25℃)— 在超纯水中使用磷酸钠,一元(货号:S0751)制备8.04 mg/ml溶液。在25 ℃下用1 M NaOH溶液将pH调节至7.6。

底物溶液(0.25 mM Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯)— 在缓冲液中使用Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE,货号:B4500)制备0.086 mg/ml溶液。

HCl溶液(1 mM盐酸)— 在超纯水中制备1 M盐酸溶液(货号:318949)的1,000倍稀释溶液。

酶溶液(胰蛋白酶) — 在使用前,立即在冷的(2-8℃)HCl溶液中制备含有425-575单位/ml胰蛋白酶的溶液。

 

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序的操作步骤

在3.20 ml反应混合物中,最终浓度为62.8 mM磷酸钠,0.23 mM Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯,0.031‑0.063 mM盐酸,和42.5‑115.0单位胰蛋白酶。

1. 移取以下试剂到合适的石英比色皿中

试剂 空白 (ml) 测试 (ml)
底物溶液 3.00 3.00
HCl溶液 0.200 0.125

注意:一式三份执行测试。


2. 倒置混合,并在适当恒温的分光光度计中平衡至25℃。然后添加:

试剂 空白 (ml) 测试 (ml)
酶溶液 0.075

注意:每个比色皿中的最终体积必须为每定义单位3.2 ml。

3. 立即通过倒置混合,并记录A253的增加5分钟。使用1分钟时间段和至少4个数据点,使用空白和测试的最大线性速率获得ΔA253/分钟。

 

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序的结果

计算

1.

式中:
df = 稀释因子
0.001 = 基于单位定义的A253 / 分钟的变化
0.075 = 测定中使用的测试样品的体积(ml)
注意:由于单位定义是基于3.2 ml,因此计算中不使用比色皿中的总体积。

2.

单位/mg固体 = 单位/ml酶
mg固体/ml酶

 

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序的材料

     

 关于胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的酶学测定程序的参考文献

  1. Bergmeyer, H.U. et al., in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) Volume I, 2nd ed., Academic Press, Inc., (New York, NY:1974) 515-516.

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