终点 PCR:特异性和收率增强的抗体介导的热启动 PCR 方案


 引言

为什么要使用热启动 Taq?

当 PCR 反应在室温下进行时,在测定过程中,非特异性扩增可通过以下途径发生:

  • 引物与非特异性模板的结合
  • 形成引物二聚体,允许引物使用其他引物作为模板。

在热启动 PCR 中,Taq 聚合酶在加热之前是无活性的。热启动 PCR 激活方法允许用户在增加目标收率和特异性的同时最小化非特异性扩增。

我们的热启动技术是如何工作的?

我们的 JumpStart Taq DNA 聚合酶是一种抗体失活的热启动酶。在最初的变性 PCR 步骤中,Taq DNA 聚合酶活性得以恢复。得到的 PCR 表现出更高的特异性和收率。与化学变性的热启动不同,酶激活可能需要 10 min,抗体介导的热启动酶则可在 1 min 内被激活。

抗体介导的热启动 PCR 机制


 设备

  • 移液器分配体积,从 <1 到 200µL
  • 台式微量离心机
  • 热循环仪
  • 电泳设备
  • 紫外透射仪


 用品

  • 无菌过滤移液器吸头
  • 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管(如 CLS430909
  • PCR 试管,选择以下其中一种以匹配所需格式:
  • dNTP 混合物,dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 10 mM( D7295,仅标准格式试剂需要)
  • 酶和缓冲液,查看下表,为您的应用定义最佳试剂:
  •  

    热启动 DNA 聚合酶
    标准格式——独立组分 Readymix-预混 PCR mastermix
    含 MgCl2 独立 MgCl2
    (用于 MgCl2 优化)
    含 MgCl2
    用红色染料直接加载到凝胶上 无色配方
    无染料
    无色配方
    无染料
    无色配方
    无染料
    用红色染料直接加载到凝胶上
    JumpStart™ REDTaq ® DNA 聚合酶 (D8187) JumpStart™ Taq DNA 聚合酶,含 MgCl2 (D9307) JumpStart™Taq DNA 聚合酶,不含 MgCl2  (D4184) JumpStart™ Taq ReadyMix™(P2893) JumpStart™ REDTaq®
    ReadyMix™  
    (P1107)

     

  • DNA 标记,根据您的 PCR 扩增子大小选择合适的标记
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    产品名称(产品编号) DirectLoad™ step Ladder, 50 bp (D3812)
    DirectLoad™ PCR 100 bp Low Ladder (D3687)
    DirectLoad™ 1kb DNA Ladder (D3937)
    大小范围 50bp – 3,000bp 100bp – 1,000bp 500bp -10,000bp
    梯状条带图

     

  • PCR 级水(W1754)
  • DNA/cDNA 模板
    • cDNA 反应 1:10 稀释以检测高表达的靶标培养基或 1:2 到 1:5 稀释以检测稀有转录物或 10 ng 到 100 ng gDNA
  • 稀释至工作浓度的引物(10µM 工作原液对大多数检测来说已经足够)


 方法

  1. 将 DNA 聚合酶置于冰上或-20ºC,在室温或冰上解冻剩余的反应组分,旋转混合,短暂离心,冰上更换。
     
  2. 设置 PCR 反应
    1. 制备包含所有反应组分的主混合物,DNA/cDNA 模板除外。
      1. 通过所需反应次数乘以数量计算所需的主混合物,包括对照品,然后加入 10%,确保足够量的所有样品。

         

        用于标准格式的热启动 DNA 聚合酶
        组分 最终浓度 
        (在 25 μL 反应中)
        主混合物体积 
        (μL) 一次反应
        PCR 缓冲液 (10X) 1X 2.5 μL
        氯化镁 (50 mM) 2.5 mM 1.25 μL
        正向/反向引物(10 μM 原液) 50-500 nM 可变
        dNTP 混合物(每个核苷酸 10 mM) 0.2 mM 0.5 μL
        Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.05 单位/μL 0.25 μL
        PCR 级水   最多 20µL 最多 20µL
        总体积 (μl)   20 μL

        注:如果 PCR 缓冲液中尚未加入氯化镁,或者先前的优化显示一定的浓度要求,则单独加入氯化镁。

         

        用于 ReadyMix 格式的热启动 DNA 聚合酶
        组分 最终浓度 
        (在 25 μL 反应中)
        主混合物体积 
        (μL) 一次反应
        JumpStart Taq ReadyMix (2X) 1X 12.5 μL
        正向/反向引物(10 μM 原液) 50-500 nM 可变
        PCR 级水 最多 20µL 最多 20µL
        总体积 (μl)   20 μL

       

    2. 将反应组分合并到冰上的 1.5 mL 微量离心管中

  3. 通过上下小心移液来混合主混合物,确保所有混合物都从移液器吸头排出,然后短暂地脉冲或离心以收集管底部的样品。

  4. 将 20 μL master mix 分装到所需数量的 200 μL 薄壁 PCR 管中(为样品编号,包括重复样品和对照样品)

  5. 加入 5 μL DNA 模板样品(含总量为 10 ng~100 ng gDNA 或将cDNA 样品从 1:2 稀释到 1:10)至 25 μL 的最终反应体积。
     
  6. 旋转 PCR 管,放入带有加热盖的热循环仪中。
     
  7. 确定引物的合适退火温度 (Ta)。可以使用比 Tm 最低的引物的 Tm 低 5ºC 的 Ta 进行很好的首次检测。
     
  8. 执行以下热循环规程。
    1. 95°C for 2-10 min
    2. 95°C for 30 sec; 48-60°C (Ta) for 30 sec; 72°C for 0.5-2 min] 25-50 循环
    3. 72°C for 10 min

  9. 通过琼脂糖凝胶电泳分析已完成反应的等分试样,并在透照器上或通过其他选择的分析方法观察。


 材料